[发明专利]一种小桐子组培苗原生质体的制备及基因瞬时表达的方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学及基因工程技术领域，特别涉及一种小桐子组培苗原生质体的制备及基因瞬时表达的方法。

背景技术

小桐子(JatrophacarcasL.)，又名麻疯树，为大戟科麻风树属落叶灌木或小乔木。小桐子种子含油率高，经过加工可制成生物柴油，有着较强的市场开发潜力和应用前景。瞬时表达技术是在相对短的时间内将目标基因转入靶细胞内，获得该基因短暂的高水平表达的技术，是一种快速、方便的研究基因-蛋白质的方法。目前，关于获得小桐子原生质体的技术信息十分匮乏。因此，我们通过已有的拟南芥原生质体制备的方法，调整改进后可以获得小桐子高活性的原生质体，可以用于瞬时表达分析研究。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种小桐子组培苗原生质体的制备及基因瞬时表达的方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种小桐子组培苗原生质体的制备及基因瞬时表达的方法，包括以下操作步骤：

(1)称取1.82g甘露醇溶于20ml双蒸水中，配制甘露醇溶液装在灭菌小烧杯里；

(2)在超净台上取小桐子组培苗叶片，用刀片切成0.5～1mm宽的叶条，将切好叶条放入甘露醇溶液中；

(3)将叶条捞出放入预先配好的装有15ml酶解液的50ml锥形瓶中，避光，22～25℃静置酶解6～7h；当酶解液变绿时摇晃锥形瓶，促使原生质体释放出来；

(4)加入15ml等体积预冷的W5溶液，用100目的滤网进行过滤，滤液于50ml圆底离心管中置于冰上；

(5)用离心力80g离心2min，去除上清，沿管壁加入5ml预冷的W5溶液，冰上放置30min，同时取20μl溶液用细胞计数板计数；

(6)原生质体沉淀在离心管底部，去除上清，用MMg溶液将原生质体悬浮制成浓度为2х10⁵个/mL的原生质体悬浮液；

(7)在2ml的灭菌离心管中加入10μl的质粒DNA溶液；质粒DNA溶液中含有10～20μg质粒DNA；

(8)向步骤(7)所得质粒DNA溶液中加入100μl步骤(6)所得原生质体悬浮液；

(9)再加入110μlPEG4000/Ca²⁺溶液，用剪头的枪头吸打混匀；

(10)22～25℃下避光诱导转化混合物15～30min；

(11)加入440μl的W5溶液稀释转化混合液，然后颠倒离心管使之混合以终止转化反应；

(12)80g离心2min然后去除上清；

(13)再用1ml的W5溶液重悬原生质体于六孔组织培养皿中，在W5溶液中加入50μl/ml氨苄青霉素；

(14)在避光和23℃条件下培养原生质体18～40h；

(15)用离心力80g离心2min，然后去上清，留下10～20μl的溶液，在激光扫描共聚焦显微镜下观察基因瞬时表达；

所述酶解液是按照以下方法制备得到：将纤维素酶R10(CellulaseR10)、离析酶R10(MecerozymeR10)、甘露醇(mannitol)、氯化钾(KCl)和pH为5.7的2-吗啉乙磺酸(MES)加入到ddH₂O中混合后，55℃水浴加热10分钟；冷却至室温后加入氯化钙(CaCl₂)、牛血清蛋白(BSA)和β-巯基乙醇(β-Mercaptoethanol)，用0.45μm滤膜过滤后，得到酶解液；各组分在酶解液中的浓度如下：质量分数2.0﹪的纤维素酶R10、质量分数0.4﹪的离析酶R10、0.4M甘露醇、20mM氯化钾、20mM2-吗啉乙磺酸、10mM氯化钙、质量分数0.1﹪的牛血清蛋白、50μlβ-巯基乙醇；

所述W5溶液是按照以下方法制备得到：将葡萄糖(glucose)、氯化钠(NaCl)、氯化钙(CaCl₂)、氯化钾(KCl)和pH为5.7的2-吗啉乙磺酸混合后，用0.45μm滤膜过滤后使用；各组分在W5溶液中的浓度如下：5mM葡萄糖、154mM氯化钠、125mM氯化钙、5mM氯化钾、2mM2-吗啉乙磺酸；

所述MMg溶液是按照以下方法制备得到：将氯化镁(MgCl₂)、pH为5.7的2-吗啉乙磺酸和0.4M甘露醇混合后，用0.45μm滤膜过滤后使用；各组分在MMg溶液中的浓度如下：15mM氯化镁、4mM2-吗啉乙磺酸、0.4M甘露醇；