[发明专利]一种用细胞系生产鸡传染性喉气管炎活疫苗的方法

权利要求书

1.一种用细胞系生产鸡传染性喉气管炎活疫苗的方法，其特征在于，其选用细胞系代替鸡胚进行鸡传染性喉气管炎病毒液的增殖，步骤如下：

（1）筛选鸡传染性喉气管炎病毒培养细胞系：根据鸡传染性喉气管炎病毒生物学特性，选取BHK-21细胞、Vero细胞、DF1细胞、原代鸡胚成纤维细胞（CEF）、鸡胚肝细胞、鸡胚肾细胞，前两种细胞采用DMEM培养液进行培养，后四种细胞使用M199培养液，分别进行所述病毒的培养，得病毒株适应性细胞；

（2）筛选细胞的克隆纯化：对步骤（1）中所得的病毒株适应性细胞用8%胎牛血清培养液进行稀释，稀释浓度为2个细胞/ml，加入48孔细胞板中，0.3ml/孔进行细胞克隆培养，选取细胞生长均一、轮廓清晰、透亮，细胞内无杂质的细胞孔进行消化冻存备用；

（3）制苗细胞的传代、培养：

（4）病毒株的克隆、培养：采用步骤（2）中的克隆细胞进行病毒株的蚀斑克隆培养，共克隆四次，一次克隆分别选取三个最小蚀斑，分别进行后三次的克隆，最终分别繁殖克隆三个毒株，筛选出毒力最弱、免疫原性最强的制苗毒株，并对所述毒株进行适应性培养；

（5）制苗用毒液的制备：用M199培养液对步骤（4）制苗毒株进行稀释，接种于长满单层的制苗细胞中，于培养箱中吸附，待吸附后弃去稀释液，补加细胞维持液，进行病毒的培养，最终收获细胞悬液备用；

（6）疫苗的配制及分装：收获步骤（5）中的制苗毒液，加入保护剂，充分混匀，定量分装；

（7）冻干。

2.根据权利要求1所述的一种用细胞系生产鸡传染性喉气管炎活疫苗的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述鸡传染性喉气管炎病毒为K317株。

3.根据权利要求2所述的一种用细胞系生产鸡传染性喉气管炎活疫苗的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述细胞生长液为M199，所用血清为8～12%胎牛血清，培养PH为7.0～7.4；所述细胞经3～5次单克隆培养处理，条件为，细胞：细胞孔=2：1。

4.根据权利要求3所述的一种用细胞系生产鸡传染性喉气管炎活疫苗的方法，其特征在于，步骤（3）中，细胞传10～15代。

5.根据权利要求4所述的一种用细胞系生产鸡传染性喉气管炎活疫苗的方法，其特征在于，步骤（5）中，制苗毒液采用PH值为7.4～7.6的100%M199营养液进行稀释，以1g尿囊膜中加入1ml所述营养液的方式获得ILT病毒原液，最终以0.5～1%接种量接种；病毒吸附的时间为1～2小时；所述制苗细胞维持液为97%M199营养液和3%胎牛血清，PH值为7.4～7.6。

6.根据权利要求5所述的一种用细胞系生产鸡传染性喉气管炎活疫苗的方法，其特征在于，步骤（6）中，所述保护剂为10%～15%的脱脂牛奶蔗糖。