[发明专利]一种Protein D与HER2融合蛋白及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白由所述佐剂蛋白通过接头(Linker)或直接连接的方式与肿瘤相关抗原的N端或C端连接形成；其中，

所述佐剂蛋白包含流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae，Hi)蛋白D或所述流感嗜血杆菌蛋白D的片段；

所述肿瘤相关抗原包含氨基酸序列为SEQIDNO：3的HER2蛋白质或其片段；优选地，所述肿瘤相关抗原由人HER2抗原胞外区片段和HER2表位肽片段组合形成，所述HER2抗原胞外区片段的氨基酸序列为SEQIDNO：4，所述HER2表位肽片段的氨基酸序列为SEQIDNO：5；

优选地，所述佐剂蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO：2；

优选地，所述接头的氨基酸序列为-GGGGSGGGGSGGGGS-；优选地，所述佐剂蛋白通过直接连接的方式与所述肿瘤相关抗原的N端连接。

2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO：6。

3.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体由编码如权利要求1或2所述的融合蛋白的核苷酸序列连接商业化载体以及任选地加入酶切识别位点序列和/或编码蛋白质标签的序列构建而成，所述商业化载体选自pET-28a-c(+)、pET29a、pET-30a-c(+)、pET39b(+)、pET-40b(+)、pET-41a(+)以及pET-43.1a(+)中的一种或多种；优选地，所述核苷酸序列为SEQIDNO：7。

4.如权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体还包含位于所述核苷酸序列5’端的依次排列的酶切识别位点、组氨酸标签和肠激酶位点对应的编码核酸序列，优选地，所述依次排列的酶切识别位点、组氨酸标签和肠激酶位点对应编码核酸序列SEQIDNO：8。

5.如权利要求3或4所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体还包含位于所述核苷酸序列3′端的终止密码子序列和酶切识别位点序列；优选地，所述终止密码子序列和酶切识别位点序列为SEQIDNO：9；更优选地，编码所述融合蛋白的核苷酸序列为SEQIDNO：12。

6.含有如权利要求3～5中任一项所述的表达载体的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为细菌或真菌；优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌；更优选地，所述大肠杆菌选自BL21(DE3)、BL21(DE3)PlysS或TB1。

7.一种如权利要求1或2所述的融合蛋白的制备方法，其特征在于，将权利要求6所述的宿主细胞经IPTG诱导融合蛋白表达，收集包涵体，提取包涵体中的融合蛋白，纯化得到融合蛋白；

优选地，所述纯化是通过下述方法实现的：

将融合蛋白通过螯合层析柱进行纯化。

8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述纯化步骤还包括：

以肠激酶酶切融合蛋白，然后将酶切后的融合蛋白上样于酶切目的蛋白上样于Ni2+-ChelatingSepharoseFastFlow，再以浓度为50mM的咪唑洗脱。

9.一种HER2抗原阳性肿瘤疫苗，其特征在于，所述疫苗包含如权利要求1或2所述的融合蛋白；优选地，所述疫苗为HER2抗原阳性肿瘤治疗性疫苗；优选地，所述抗原阳性肿瘤为乳腺肿瘤。

10.如权利要求9所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗还包含佐剂，所述佐剂选自GM-CSF、CpG和GM-CSF+CpG；优选地，所述疫苗的剂型为注射剂。