[发明专利]基于上转换的新型光控活细胞染色方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于上转换纳米颗粒的光控染料释放并对活细胞进行靶向着色的新方法，属生物技术和医学领域。

背景技术

细胞染色技术是生命科学、基础医学和诊断学等领域非常重要的科研和临床诊断的手段之一。但是在活细胞中，普通染料(如罗丹明和4',6-二脒基-2-苯基吲哚等)很难通过细胞膜，使得活细胞的着色非常困难，所以传统细胞染色过程中，常常需要先用甲醛、丙酮等化学试剂将细胞固定,再用染料对细胞进行着色,这些化学试剂通常会破坏细胞膜，这一过程也就导致了细胞的死亡，无法实现活细胞的生理状态的观察。

目前，虽然在细胞染色过程中也出现了一些新型的活细胞染色试剂，可以顺利穿透细胞膜(比如钙黄绿素)来实现对活细胞的着色，但这些染料在释放时也常存在“着色时间和剂量不可控，半衰期短，无细胞特异性，无法对完整生物体进行着色”等缺陷，导致在细胞染色时常需要将组织块或者细胞群落分散成游离的单个细胞，再对其进行着色。这种染色方法对细胞着色无特异性，无法区分出正常细胞和肿瘤细胞，并且只能对细胞进行一次染色，而对分裂、增殖细胞的染色效果不理想。因此研制新型的活细胞染色技术，实现对活细胞乃至活体特异部位着色的新型染色技术具有重要的科研和临床应用价值。

发明内容

根据现有技术的不足，我们提出新型染料技术，主要集中于如何有效向活细胞中投递任意染料，并实现染料的定位定量释放。

具体技术方案如下：

本发明的基于上转换的光控活细胞染色方法；步骤如下：

1)利用纳米级染料载体系统，将细胞浆染料或者细胞核染料包裹进入纳米颗粒的介孔中成为一个染料库；

2)利用染料载体系统表面的靶向修饰功能，通过主动靶向作用将染料输送到所需细胞和组织；

3)利用纳米颗粒中的上转换核心作为光源转换器，将近红外光转换成原位的紫外光和可见光，位于纳米载体表面的大量光感分子在紫外光和可见光的驱动下构象发生反复变化，从而促进分子马达的运转。本发明便可以通过控制近红外光的照射部位和时间来选择性地将纳米颗粒内的有机染料释放出来，最终实现靶向细胞的可控制性着色。

所述的纳米颗粒；其包括稀土上转换纳米颗粒子核；核外包裹介孔二氧化硅壳层；壳层表面修饰光敏分子偶氮苯及靶向叶酸分子。

本发明所述的纳米颗粒制备方法，步骤如下：

(1)按照质量分数比为氯化钇：氯化镱：氯化铥＝(500～750):(150～250):0.3将原料加入到反应器中，然后向反应器中加入溶剂水使上述物质完全溶解；在磁力搅拌条件，加热至沸腾，直至稀土盐溶液变成白色固体；

(2)水蒸干后，冷却至60～80℃，按照体积比为油酸：十八烯＝2～3:1将二者加入反应器中使白色固体完全溶解；

(3)按照质量数为NaOH：氟化铵＝1～6：3将二者加入的反应器中加入甲醇使其完全溶解，氟化铵与上述氯化铥的质量比＝3:1；调节温度升温到120～150℃，抽真空30～50min，通氩气；迅速升温到260～300℃，维持反应1～3h；结束后加入丙酮离心纯化，真空干燥处理后得到稀土上转换纳米颗粒。

所述的包裹介孔二氧化硅壳层的制备方法：采用公开的常津，王汉杰等发明(公开号：CN104771756A)，化疗用稀土上转换光控药物释放纳米制剂及其制备方法：

(1)取稀土上转换纳米颗粒：十六烷基三甲基溴化铵：氢氧化钠＝1：(50～200)：(5～20)将原料加入到反应器中，然后向反应器中加入水使上述物质完全溶解，磁力搅拌条件下加热到50～80℃，搅拌1～2h；

(2)然后加入正硅酸乙酯，其中正硅酸乙酯与稀土上转换纳米颗粒的质量比＝0.01～0.5：1；反应1～2h后，离心纯化；

(3)将(2)中的颗粒分散到乙醇中，加入氯化钠作为除模板剂，其中氯化钠与颗粒的质量比＝10～50：1，磁力搅拌条件下加热到50～80℃，搅拌3～9h；反应完全后离心纯化，产物真空干燥处理后得到介孔硅壳层包覆的上转换纳米颗粒。

本发明所述的壳层表面修饰光敏分子偶氮苯及靶向叶酸分子的方法，步骤如下：

(1)按照物质的质量分数比为4-苯偶氮苯甲酰氯：叶酸：3-氨丙基三乙氧基硅烷＝1：(1～50)：(1～6)将原料加入到反应器中，然后向反应器中加入溶剂二甲基亚砜将上述物质完全溶解，避光条件下搅拌5～10h；