[发明专利]抗凝血因子VIII单克隆抗体的杂交瘤细胞株

说明书

本发明涉及分泌抗人凝血因子VIII单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其制备方法。本发明通过用牛血清白蛋白BSA与人凝血因子VIII偶联后的偶联物作为抗原免疫Balb/c小鼠，取其脾脏细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合，用HAT培养基进行选择性培养，利用有限稀释法通过多次克隆化，最后筛选获得稳定分泌抗人凝血因子VIII单克隆抗体的杂交瘤细胞株。根据本发明制备的一株杂交瘤细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC C2015196。

技术领域

本发明涉及杂交瘤细胞株及其制备方法，具体地，涉及抗人凝血因子VIII单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其制备方法。

背景技术

凝血因子是参与凝血过程的一种重要蛋白质成分。它的生理作用是，在血管出血时被激活，和血小板粘连在一起补塞血管上的漏口。这个过程被称为凝血。在血友病患者中，80％的病人是血友病A，即甲型血友病，该类病人主要缺少正常人所拥有的凝血因子VIII。甲型血友病是一种终生性疾病，目前仍没有根治的方法，只能通过输注人凝血因子VIII替代产品进行治疗。

凝血因子VIII分子结构复杂，分子量为330kDa，是一种较大的血浆蛋白分子。其在血浆中的含量仅为0.1-0.2μg/mL，半衰期约为12小时。由于其提取技术非常困难，而我国在大规模亲和层析技术上比较落后，目前尚没有亲和层析法制备的高纯凝血因子类产品问世。因此，造成了目前国内市场上凝血因子VIII产品严重不足，不能充分供给国内甲型血友病患者使用，经常会出现断药的情况，危害国内患者的健康和生命安全。

血浆蛋白的层析分离技术的难点在于血浆的高粘度和一次处理的巨大体积。对于凝血因子类微量血浆蛋白的分离，亲和层析是最佳的纯化方式。目前，国际上多数企业，包括最大的血液制品企业CSL也采用低温乙醇联合层析的方法来分离血浆蛋白。在上世纪90年代，百特已采用抗体亲和层析法来制备超纯VIII因子和VII因子，比活性可达3000IU/mg,总体活性回收率超过30％。而我国目前制备VIII因子则仍采用冷沉淀粗制获得，比活性多低于100IU/mg，活性回收率约在6％左右。

因此，为了利用亲和层析大幅度提高凝血因子的分离效率，其关键技术瓶颈是制备有效的亲和层析用抗体。因而，本领域中存在着对特异性凝血因子VIII单克隆抗体的需求。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种分泌抗人凝血因子VIII单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其制备方法。

在第一个方面，本发明提供了一种制备分泌抗人凝血因子VIII单克隆抗体的杂交瘤细胞株的方法(在本文中有时也简称为“本发明的方法”)，所述方法包括以下步骤：

1)制备免疫抗原：通过同型双功能蛋白交联剂将人凝血因子VIII与牛血清白蛋白偶联，得到人凝血因子VIII-牛血清白蛋白偶联物；

2)免疫小鼠：采用小剂量长周期免疫方案，利用步骤1)中得到的人凝血因子VIII-牛血清白蛋白偶联物作用免疫抗原，对Balb/c小鼠进行免疫；

3)细胞融合：将SP2/0小鼠骨髓瘤细胞与步骤2)获得的免疫Balb/c小鼠的脾脏细胞融合，在含有HAT的RPMI-1640培养基中进行选择性培养；

4)杂交瘤细胞的选择性培养：在步骤3)中融合后的细胞在HAT培养基中选择性培养后，选择小鼠脾脏细胞与小鼠杂交瘤细胞SP2/0的融合细胞；以及

5)单克隆化：将步骤4)中获得的经检测为阳性的杂交瘤细胞经有限稀释法进行多次单克隆获得稳定分泌抗人凝血因子VIII单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

在第二个方面，本发明提供了分泌抗人凝血因子VIII单克隆抗体的杂交瘤细胞株(下文中有时称为“本发明的杂交瘤细胞株”)，所述杂交瘤细胞株是通过本发明的方法制备的。