[发明专利]利用荧光定量PCR技术鉴定陆地棉品种抗黄萎病的基因及方法

权利要求书

1.陆地棉品种抗黄萎病鉴定相关基因，其特征在于包括序列表中SEQ ID NO：1所示的多向耐毒性基因和SEQ ID NO：2所示的转录子基因。

2.陆地棉品种抗黄萎病鉴定相关基因的PCR扩增特异引物，其特征在于多向耐毒性基因的特异引物上游序列见SEQ ID NO：3，下游序列见SEQ ID NO：4；转录子基因特异引物上游序列见SEQ ID NO：5，下游序列见SEQ ID NO：6。

3.利用荧光定量PCR技术鉴定陆地棉品种抗黄萎病的方法，其特征在于包括如下步骤：①待测棉花品种营养钵培养室育苗；②黄萎病病菌培养；③病菌浸根接种：用步骤②培养的病菌菌液对步骤①育成的幼苗进行浸根接种；④总RNA提取：摘取步骤③中被病菌侵染过的幼苗嫩片，提取叶片总RNA；⑤cDNA合成；⑥与陆地棉抗性相关关键基因即SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示基因，以及内参基因GhACTIN14的荧光定量PCR特异引物的合成；⑦荧光定量PCR检测；⑧结果分析。

4.根据权利要求3所述的利用荧光定量PCR技术鉴定陆地棉品种抗黄萎病的方法，其特征在于步骤①所述的待测棉花品种营养钵培养室育苗采用塑料周转箱内纸质营养钵培养室育苗，培养条件：平均温度28℃，每天保持光照14个小时。

5.根据权利要求3所述的利用荧光定量PCR技术鉴定陆地棉品种抗黄萎病的方法，其特征在于步骤③所述的病菌浸根接种，是指当待测棉花品种幼苗长至6叶期开始进行病菌浸根接种，病菌孢子浓度为10^6-10⁸个/ml的孢子悬浮液。

6.根据权利要求3所述的利用荧光定量PCR技术鉴定陆地棉品种抗黄萎病的方法，其特征在于步骤④所述的总RNA提取，提取的是病菌接种侵染0h和48h时的幼苗嫩片中的总RNA。

7.根据权利要求3所述的利用荧光定量PCR技术鉴定陆地棉品种抗黄萎病的方法，其特征在于步骤⑤所述的cDNA合成反应体系为步骤④中提取的总RNA 2μl，Anchored oligo(dT)18 primer浓度为0.5μg/μl，1μl，2×TS Reaction Mix 10μl，Transcript RT/R1Enzyme Mix 1μl，gDNA Remover 1μl，Rnase-free water 5μl。

8.根据权利要求3所述的利用荧光定量PCR技术鉴定陆地棉品种抗黄萎病的方法，其特征在于步骤⑥所述的与陆地棉抗性相关关键基因和内参基因GhACTIN14的的荧光定量PCR特异引物的合成，合成引物GC含量50％，Tm在60℃-62℃，长度18-22个核苷酸，扩增片段80-150bp；合成的序列表中SEQ ID NO：1所示基因特异引物序列：上游序列见SEQ ID NO：3，下游序列见SEQ ID NO：4；合成的序列表中SEQ ID NO：2所示基因特异引物序列：上游序列见SEQ ID NO：5，下游序列见SEQ ID NO：6；合成的内参基因GhACTIN14特异引物序列：上游序列见SEQ ID NO：7，下游序列见SEQ ID NO：8。

9.根据权利要求3所述的利用荧光定量PCR技术鉴定陆地棉品种抗黄萎病的方法，其特征在于步骤⑦所述的荧光定量PCR检测，反应体系为Premix Ex Taq TM 10μl，步骤⑥中合成的相应被检测基因的特异上游引物浓度为10pm/μl，0.4μl，下游引物浓度为10pm/μl，0.4μl，ROX Reference Dye 0.4μl，灭菌蒸馏水7.8μl，cDNA 2μl；RT-PCR反应程序：预变性95℃，30s；95℃，5s，60℃，34s，40个循环。

10.根据权利要求3所述的利用荧光定量PCR技术鉴定陆地棉品种抗黄萎病的方法，其特征在于步骤⑧结果分析所依据的检测标准是，利用荧光定量PCR数据采用相对定量2^-ΔΔCt法，在接种黄萎病菌后48h序列表中SEQ ID NO：1所示基因相对表达量倍值大于2和序列表中SEQ ID NO：2所示基因相对表达量倍值小于1的判定为抗病品种；在接种黄萎病菌后48h序列表中SEQ ID NO：1所示基因相对表达量倍值小于1和序列表中SEQ ID NO：2所示基因相对表达量倍值大于2的判定为感病品种。