[发明专利]一种基于自然转化的副猪嗜血杆菌高效遗传重组方法及应用

说明书

本发明公开了一种基于自然转化的副猪嗜血杆菌高效遗传重组方法及应用，属于细菌遗传改造技术领域。本发明中通过在上游引物中添加USS序列ACCGCTTG，使的PCR产物含有这个USS序列，副猪嗜血杆菌会识别并带入菌体内部进行重组，无需构建突变常用的自杀质粒，本方法把抗性基因直接引入到PCR产物中，直接用PCR产物就能实现筛选，同时在引物中引入USS，细菌就会直接吞噬这个重组模版用于同源重组。本发明的基于自然转化的副猪嗜血杆菌高效遗传重组方法在构建副猪嗜血杆菌双组分系统突变体中应用。

技术领域

本发明属于细菌遗传改造技术领域，特别涉及一种基于自然转化的副猪嗜血杆菌高效遗传重组方法及应用。

背景技术

同源重组技术常用于细菌基因功能研究或遗传改造，同源重组技术是利用已构建好的带有目标基因敲除盒的外源质粒载体通过一定方式引入菌体细胞，带有同源序列的片段会与目标基因进行同源配对，在多个重组相关蛋白的作用下实现DNA片段交换，从而实现细菌目标基因改造的目的。要实现外源质粒载体的导入通常用到接合转移，电击转化或自然转化等方法，其中自然转化是指菌体高效吸收和整合外源核酸DNA的能力，一般认为自然转化能力的出现是细菌利用外源DNA作为营养物质或修复自身基因组损伤的一种机制。利用自然转化的特性，至今已证实有多种细菌能通过这种方式成功实现基因定向突变，是实现细菌遗传研究的有效手段之一。

目前，大部分关于副猪嗜血杆菌(H.parasuis)突变体的构建主要是通过自然转化的方法实现的，Bigas等首先发现H.parasuis存在环腺苷酸(cAMP)依赖的自然转化现象，能获取含有吸收信号序列(uptake signal sequence，USS)的外源核酸片段，利用此特性，Bigas等首次在H.parasuis上构建出了胸苷酸合成酶(thyA)基因缺失突变株。

随后有多项研究通过自然转化的方法构建多个H.parasuis突变体，包括外膜蛋白ompP2和ompP5基因，脂寡糖合成相关基因opsX、rfaF和waaQ，半乳糖代谢相关基因galUE以及细胞肿胀毒素基因cdtABC，此外还有多个致病相关基因，并证实这些基因与H.parasuis抗补体或粘附入侵相关，为H.parasuis致病机理的研究提供了可靠的遗传研究方法。

本技术在利用自然转化的基础上进一步优化重组方法，进一步提高副猪嗜血杆菌遗传改造效率。

发明内容

为克服上述现有技术中存在的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种基于自然转化的副猪嗜血杆菌高效遗传重组方法。本发明的遗传重组方法无需构建载体，也不需要电击，直接用PCR产物跟菌混合完成；克服了传统遗传重组方法中需要构建载体和点击转化等繁琐步骤。

本发明的另一目的在于提供上述的基于自然转化的副猪嗜血杆菌高效遗传重组方法的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种基于自然转化的副猪嗜血杆菌高效遗传重组方法，具体包括以下步骤：

1)以副猪嗜血杆菌基因组为模板，设计重组目标基因的上臂扩增引物对和下臂扩增引物对，分别扩增获得目标基因上臂片段和目标基因下臂片段，其中所述的上臂扩增引物对的上游引物中包含USS序列(uptake specific sequence)；

2)扩增获得抗性标记基因，所述的抗性标记基因的前端序列与目标基因上臂片段后端序列存在部分重叠，所述的抗性标记基因的后端序列与目标基因下臂片段前端存在部分重叠片段，以目标基因上臂片段的上游扩增引物和目标基因下臂片段的下游扩增引物进行重叠PCR扩增，获得依次排列有USS序列、目标基因上臂片段、抗性标记基因和目标基因下臂片段的重组片段PCR产物；

3)将步骤2)获得重组片段与受体副猪嗜血杆菌进行自然转化，经过对抗性标记基因的筛选，获得副猪嗜血杆菌的重组突变体。

步骤1)中所述的USS序列为ACCGCTTG。