[发明专利]一种复苏骨髓间充质干细胞的方法

权利要求书

1.一种复苏骨髓间充质干细胞的方法，其特征在于，包括：

步骤1、将传代至P3-P5代的骨髓间充质干细胞按照5000-10000/cm²的细胞密度用含10％FBS的DMEM/F12培养基培养24h，用Hanks清洗后，再用无血清的DMEM培养基培养，分别在培养24h、48h、72h时收集培养基上清，1000-2000rpm离心5-10min，去除沉淀，收集所有上清混合，滤膜过滤后获得条件培养基；

步骤2、将冻存的骨髓间充质干细胞放置在35-42℃的水浴锅中，震荡温育30-60秒，然后加入到5-10倍体积的条件培养基中，以1000-2000rpm离心3-5分钟，去上清，用条件培养基重悬沉淀，吹打混匀，并按照5000-10000/cm²的细胞密度用条件培养基放置在37℃、5％CO₂培养箱静置培养24小时后，更换条件培养基继续培养至细胞融合度达到80％-90％。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述P3-P5代骨髓间充质干细胞通过以下方法获得：

从正常人骨髓样本中分离出单核细胞层，离心清洗细胞沉淀，用骨髓间充质干细胞生长培养基重悬沉淀并培养48h，然后更换骨髓间充质干细胞生长培养基继续培养至细胞融合度达到80％-90％，获得P0代；

用胰蛋白酶消化P0代贴壁细胞，离心后用骨髓间充质干细胞生长培养基重悬细胞沉淀，并传代培养，传代至P3-P5代。

3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述单核细胞层可由以下方法分离获得：

取正常人的骨髓样本加入等体积生理盐水混匀，然后用巴氏吸管吸取骨髓混合液加入到等体积的淋巴细胞分离液中，离心后用巴氏吸管吸取中间层的单核细胞层。

4.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述骨髓间充质干细胞生长培养基为含10％FBS以及10ng/mL bFGF的DMEM培养基。

5.权利要求1中所述条件培养基在复苏骨髓间充质干细胞中的应用。