[发明专利]一种提高里氏木霉纤维素酶酶活的方法

说明书

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种提高里氏木霉纤维素酶酶活的方法。包括在里氏木霉中表达外源的β‑葡萄糖苷酶基因NfBgl3A的步骤。本发明通过在里氏木霉中表达异源β‑葡萄糖苷酶，获得了纤维素酶酶活显著提高的转化子。转化子在MM‑Avicel中培养6天后，其纤维素酶的滤纸酶活0.18U/ml，较出发菌株分别提高了3.7倍。CMC酶活0.40U/ml，较出发菌株分别提高了2.9倍。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种提高里氏木霉纤维素酶酶活的方法。

背景技术

植物细胞壁主要由纤维素(cellulose)、半纤维素(hemicellulose)和木质素(lignin)组成。其中，纤维素作为构建细胞壁的主要成分，是一种由8,000-10,000个葡萄糖通过β-l,4-糖苷键连接而形成的天然线性大分子聚合物，以纤维二糖为其基本单元。据统计，目前每年至少有7×10¹¹吨纤维素多糖产生，大量存在于植物细胞壁中。因此植物细胞壁是地球上数量最多的可再生资源，是生产可再生生物燃料的理想原料。而将植物细胞壁中的纤维素多糖降解为可发酵的简单寡糖和单糖如葡萄糖需要复杂的纤维素酶酶系协同作用。

丝状真菌是工业应用上生产许多酶和有机代谢物的一类主要的微生物。其中，里氏木霉具有强大的分泌纤维素酶的能力。工业上，经改造后的里氏木霉，其产纤维素酶的产量可达到100g/L以上，因此，在降解植物细胞壁多糖以及相关应用上具有重要的应用价值。

里氏木霉的纤维素酶系包括两个外切纤维素酶、五个内切纤维素酶、一个β-葡萄糖苷酶和三个裂解性多糖单加氧酶(lytic polysaccharides monooxygenases,LPMOs，即原GH61家族成员)。其中，外切葡聚糖酶主要作用于纤维素线状分子的末端，水解β-1,4糖苷键，从还原末端(CBH1)或非还原末端(CBH2)进行水解，产生纤维二糖；内切葡聚糖酶作用于纤维素分子内部的非结晶区，随机水解β-1,4糖苷键产生不同长度的寡糖链和新的还原和非还原糖链末端；β-葡萄糖苷酶(β-D-glucosidase,EC3.2.1.21)的作用是水解纤维二糖及低分子量的纤维寡糖生成葡萄糖。

里氏木霉的胞外纤维素酶系统由60％～80％的外切葡聚糖苷酶，20％～36％的内切葡聚糖苷酶和1％的β-葡萄糖苷酶组成，这些酶协同作用将纤维素类物质转换成葡萄糖。在纤维素降解过程中，所生成的纤维二糖或寡糖的积累会抑制外切纤维素酶和内切纤维素酶的活性，而β-葡萄糖苷酶能够从非还原端将上述二者作用形成的纤维二糖或纤维寡糖水解，最终形成葡萄糖，是纤维素降解过程中关键的限速酶，这也是高效利用纤维物质的关键。

里氏木霉的胞外β-葡萄糖苷酶仅占其纤维素酶系的1％，并且其活性相对较低，从而也限制着纤维素的有效利用。因此在里氏木霉中表达具有较高活性的β-葡萄糖苷酶，增加其在纤维素酶系中的含量，就可能提高纤维素酶系的整体活性，从而提高其对纤维素的降解效率。

发明内容

本发明的目的是提供一种提高里氏木霉所分泌纤维素酶酶活的方法。

根据本发明的提高里氏木霉所分泌纤维素酶酶活的方法包括在里氏木霉中表达外源的来自嗜热真菌Neosartoryafischeri P1的、具有较强活性的β-葡萄糖苷酶基因(NfBgl3A)的步骤。

根据本发明的提高里氏木霉所分泌纤维素酶酶活的方法，以pRS424为模板，将cbh1启动子、cbh1基因片段、NfBgl3A基因片段和cbh1终止子串联拼接，构建过表达NfBgl3A基因的重组质粒。

其中，cbh1启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示：