[发明专利]一种抑制脲酶活性卵黄抗体的制备方法及应用

权利要求书

1.一种抑制脲酶活性卵黄抗体的制备方法，其特征在于：先克隆幽门螺杆菌脲酶B亚基基因片段，进行碱基突变形成特殊脲酶B基因片段，将其亚克隆到原核表达质粒载体上，转化成基因工程菌，然后在25℃～30℃的条件下通过0.1～1.0mMIPTG诱导蛋白表达，最终80-95%的重组脲酶B亚基以可溶性形式蛋白表达；经亲和层析分离纯化脲酶B亚基重组蛋白，将其与佐剂混合，制备成重组幽门螺杆菌脲酶B亚基微球疫苗，通过2-5点肌肉免疫3-4次产蛋鸡；收集鸡蛋，采用罐组式逆流提取蛋黄中卵黄抗体，用ELISA和Westernblotting技术检测卵黄抗体的滴度和特异性。

2.根据权利要求1所述的抑制脲酶活性卵黄抗体的制备方法，其特征在于：所述的基因工程菌菌株的保藏号为CGMCCNO：11509。

3.根据权利要求1所述的抑制脲酶活性卵黄抗体的制备方法，其特征在于：所述的对重组脲酶B亚基蛋白进行纯化，其通过使用Ni-NTA亲和树脂纯化幽门螺杆菌脲酶B亚基可溶性蛋白，SDS-PAGE电泳后灰度扫描表明蛋白纯度达到85%-98%。

4.根据权利要求1所述的抑制脲酶活性卵黄抗体的制备方法，其特征在于：所述的佐剂中含胞壁酰二肽5-50ug/g、脂多糖5-40ug/g。

5.根据权利要求1所述的抑制脲酶活性卵黄抗体的制备方法，其特征在于：所述的重组脲酶B亚基微球疫苗含有液体石蜡和span80，将液体石蜡和span80a按其体积比为5-9:1，并400-600rpm机械搅拌约8-12min，混合均匀制备油相，将纯化蛋白抗原与胞壁酰二肽和脂多糖溶于20mg/ml的海藻酸钠溶液中，纯化蛋白抗原、胞壁酰二肽和脂多糖的终浓度分别为150-550ug/ml、5-50ug/ml和5-40ug/ml，混匀，通过直径0.03-0.05mm的孔径喷雾干燥器喷出，于上述液体石蜡和span80a的油相中搅拌，乳化3-6h，既得微球疫苗。

6.根据权利要求1所述的抑制脲酶活性卵黄抗体的制备方法，其特征在于：所述的鸡蛋中，其抗脲酶卵黄抗体滴度达到1:10000以上。

7.根据权利要求1所述的抑制脲酶活性卵黄抗体的制备方法，其特征在于：所述的卵黄抗体的罐组式逆流提取，于低于30℃的条件多罐逆流提取6-8h,提取率达到90-98%。

8.根据权利要求7所述的抑制脲酶活性卵黄抗体的制备方法，其特征在于：所述的罐组式逆流提取蛋黄中卵黄抗体，第一次，在30℃以下取蛋黄液与UP水按1:2-5体积比混匀,缓慢搅拌1-2h,12000rpm离心10-15min,收集上清液A；第二次，取第一次离心沉淀8-20倍重量的UP水重悬第一次离心沉淀，在30℃以下混匀,搅拌1-2h,12000rpm离心10-15min,收集上清液，将此次的上清液与新鲜的蛋黄液按1:2-5比例在30℃以下混匀，用UP水补足上清液,搅拌1-2h,12000rpm离心10-15min,收集上清液B；第三次取8-20倍第二次离心获得的沉淀重量的UP水重悬第二次离心获得的沉淀，在30℃以下混匀,搅拌1-2h，12000rpm离心10-15min,收集上清液，沉淀另处理，此次获得的上清液与第一次提取离心后的沉淀在30℃以下混匀,搅拌1-2h,12000rpm离心10-15min,收集上清液；此次获得的上清液与新鲜的蛋黄液按1:2-5体积比在30℃以下混匀，用UP水补足上清液,搅拌1-2h，12000rpm离心10-15min,收集上清液C；合并上清液A、上清液B和上清液C。