[发明专利]一种快速测定脱氧核糖核酸甲基化率的方法

说明书

本发明是涉及一种快速测定脱氧核糖核酸甲基化率的方法，属于分子生物学及遗传学领域。本发明主要是采用了新的DNA序列检测方法。步骤主要包括引物和探针设计，重亚硫酸盐转化、序列扩增、探针杂交和探针检测(采用检测探针和竞争探针同时杂交提高检测精度)和DNA甲基化率确定，在效率上远远高于目前的方法，时间短，价格也便宜，具有广阔应用前景。

技术领域

本发明是一种快速测定脱氧核糖核酸(DNA)甲基化率的方法，涉及重亚硫酸盐转化和酶联免疫反应，属于遗传学和分子生物学领域。

背景技术

DNA甲基化是指S-腺苷甲硫氨酸上的甲基在甲基化转移酶的作用下转移到DNA胞嘧啶或腺嘌呤上，从而对DNA进行修饰，进而发生一系列的表观修饰。DNA甲基化是表观遗传学的重要组成部分，普遍存在于生物界中，是目前研究的热点之一。植物细胞中，DNA甲基化主要发生在C_PG，C_PN_PG和C_PN_PN三种核苷酸序列中胞嘧啶上。

目前测定目的基因DNA序列甲基化率主要是利用重亚硫酸盐转化，再通过克隆测序的方法来进行。该方法成本高，周期长，存在改进的空间。

为了更加快速、经济、准确的测定目的基因DNA序列甲基化比例，我们发明了一种新方法，并用这种方法测定了BrSP11-S₆₀基因启动子区域两个位点胞嘧啶甲基化水平。在这一技术中，我们只用24h就完成相关测定，并且本方法成本相较重亚硫酸盐转化-克隆测序法更低。这种快速测定目的基因DNA序列位点甲基化比例的新技术，对于研究、分析DNA甲基化形成和调控具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速、经济、准确测定目的基因DNA甲基化比率的新方法论。

本发明是通过重亚硫酸盐转化、序列扩增、酶联免疫反应检测三步法来测定目的基因DNA甲基化率，其过程是包括重亚硫酸盐转化、序列扩增、探针杂交(采用检测探针和竞争探针同时杂交提高检测精度)和探针检测四部分。

本发明所采用的技术方案是：

一种快速测定脱氧核糖核酸甲基化率的方法，包括下列步骤：

1)引物和探针合成

根据目的基因序列，设计引物和探针，正向引物用生物素标记；所述探针包括甲基化序列的检测探针及竞争探针，非甲基化序列的检测探针及竞争探针；检测探针用地高辛标记；

2)杂交液配置：

含有甲基化序列探针杂交缓冲液：5倍SCC缓冲液，0.3％Tween-20,10pmol甲基化序列检测探针，100pmol甲基化序列的竞争探针；

非甲基化序列探针杂交缓冲液：5倍SCC缓冲液，0.3％Tween-20,10pmol非甲基化序列检测探针，100pmol非甲基化序列的竞争探针；

3)DNA甲基化比例测定：

a)解双链的DNA经重亚硫酸盐转化处理，

b)采用步骤1)中设计的引物，以步骤a)转化后DNA作为模板进行PCR扩增；

c)杂交：将得到的PCR产物分成两份，分别与链酶亲和素包裹的磁力球结合，加入50μl变性溶液(0.5mol/L NaOH,10mmol/L EDTA)；PBST缓冲液清洗，然后分别加入200μl含有甲基化序列探针杂交缓冲液和非甲基化序列探针杂交缓冲液，50℃杂交2h。

d)信号测定：利用酶标仪在405nm检测反应颜色浓度，根据甲基化和非甲基化的颜色浓度比值，计算出DNA甲基化百分比。

做为一个具体的实例，操作如下：