[发明专利]NK细胞的体外三维扩增培养方法

权利要求书

1.一种NK细胞的体外三维扩增培养方法，其特征在于：所述培养方法包括以下步骤：

获取NK细胞；

将所述NK细胞接种于三维培养支架中进行体外三维扩增培养；其中，三维培养支架为壳聚糖-海藻酸钠支架。

2.根据权利要求1所述的NK细胞的体外三维扩增培养方法，其特征在于，所述壳聚糖-海藻酸钠支架的制备过程，包括以下步骤：

取海藻酸钠溶于蒸馏水中，壳聚糖溶于醋酸溶液中，加热溶胀；用冰醋酸分别调节壳聚糖和海藻酸钠溶液的pH至3.0～5.0后，混合均匀，真空脱泡后于-5℃～-198℃下冷冻并冻干。

3.根据权利要求2所述的NK细胞的体外三维扩增培养方法，其特征在于，所述壳聚糖-海藻酸钠支架的制备过程，还包括在壳聚糖和海藻酸钠溶液混合后，添加除镁离子以外的二价金属离子盐溶液的步骤。

4.根据权利要求1所述的NK细胞的体外三维扩增培养方法，其特征在于，获取NK细胞的过程，包括以下步骤：

获取CD34⁺造血干细胞于含有造血干细胞生长因子的干细胞培养基中进行刺激分化成NK细胞。

5.根据权利要求4所述的NK细胞的体外三维扩增培养方法，其特征在于，所述造血干细胞生长因子包括白介素-2、白介素-12、白介素-15以及白介素-18。

6.根据权利要求5所述的NK细胞的体外三维扩增培养方法，其特征在于，所述干细胞培养基中，白介素2的浓度为100-300U/ml、IL-12的浓度为0.5-4.5ng/ml、白介素-15的浓度为2-8ng/ml以及白介素-18的浓度为5-15ng/ml。

7.根据权利要求4所述的NK细胞的体外三维扩增培养方法，其特征在于，所述造血干细胞生长因子包括白介素-2，且所述造血干细胞生长因子中还添加有抗CD3单克隆抗体。

8.根据权利要求7所述的NK细胞的体外三维扩增培养方法，其特征在于，所述干细胞培养基中，白介素-2的浓度为5-15ng/ml、抗CD3单克隆抗体的浓度为5-15ng/ml。

9.根据权利要求4所述的NK细胞的体外三维扩增培养方法，其特征在于，对所述NK细胞进行体外扩增培养的步骤为：将所述壳聚糖-海藻酸钠研碎加入乙酸中复溶，并添加所述含有造血干细胞生长因子的干细胞培养基，接种所述NK细胞进行培养20-50天。

10.根据权利要求4所述的NK细胞的体外三维扩增培养方法，其特征在于，所述CD34⁺造血干细胞的获取过程，包括以下步骤：

从血细胞中分离出单个核细胞，经磁珠分选出CD34⁺造血干细胞。