[发明专利]小麦成熟胚愈伤组织诱导培养及植株再生体系的构建方法

说明书

国家自然科学基金（编号：31071671）和天津市科委青年基金项目（14JCQNJC14900）天津市科技支撑重点（11ZCKFNC00700）资助。

技术领域

本发明属于农业生物技术工程，涉及小麦成熟胚愈伤组织诱导、再分化、再生植株以及大田移栽、结籽一系列过程，在小麦分子育种及小麦基因转化方面有重要应用。

背景技术

小麦是我国主要粮食作物之一，在生产上，逆境胁迫和病虫害制约着小麦产量和质量，培育抗逆、抗病、优质的小麦品种是解决这一问题的有效途径之一。目前小麦育种的主要技术有基因工程育种、细胞工程育种、轮回选择育种等，利用基因工程育种能打破种间隔离，缩短育种年限，对小麦进行定向改良具有广阔的应用前景。从方法上来说，转基因技术可分为依赖和不依赖植物组培两类，依赖植物组织培养常见的转基因方法有基因枪法和农杆菌介导法。然而与烟草、大豆和水稻等其它作物相比，小麦组织培养再生率低，遗传转化难度大，这阻碍了转基因技术在小麦育种中的应用。优化小麦再生体系提高其植株再生率是小麦转基因研究的重要基础工作。

不同基因型小麦愈伤组织的再生能力差异很大，外植体的选择也对植株再生能力具有很大影响。目前小麦的幼胚（He等，1986）、成熟胚（刘芳等，2010）、花药（庄家骏等，1984；韩晓峰等，2010）、幼穗（Chin等，1977）等多种材料均已被选作外植体进行愈伤组织诱导和植株再生研究。由于来源于幼胚的愈伤组织再生能力较强，所以大多数学者以幼胚为外植体进行诱导、研究，但小麦幼胚的获得受季节限制、幼胚的消毒程度不易控制：消毒力度小，在后续的诱导培养中容易染菌；消毒力度大又会抑制愈伤组织生长，降低诱导率，与幼胚相比，成熟胚为外植体，具有易于消毒，取材方便，不受季节限制等优点，但再分化率较幼胚低。因此本发明以成熟胚为外植体，在种子消毒、成熟胚处理、激素浓度、诱导、分化、生根培养基的组成等进行优化，以期获得高频再生率的成熟胚愈伤组织诱导及植株再生体系，为小麦遗传转化提供重要的基础性材料。

发明内容

本发明公开了一种通过小麦京411成熟胚为外植体，构建愈伤组织诱导、植株再生及获得再生籽粒体系，为小麦遗传转化提供重要的基础性材料。

为实现上述目的，本发明公开了如下的技术内容：

一种小麦成熟胚愈伤组织诱导培养及植株再生体系的构建方法，其特征在于按如下的步骤进行：

（1）植物材料：选取色泽、大小均匀的冬小麦栽培品种，70%(w/w)酒精处理5min，无菌水冲洗2-3次，用50%(w/w)次氯酸钠消毒30min，无菌水冲洗3次，4℃冷藏2h后取出再用无菌水冲洗一次；所述的小麦栽培品种指的是：京411、Brock、春麦S10鉴-6、春麦津强5号；

（2）诱导和再生培养基的筛选：通过对6个诱导培养基、8个分化培养基的筛选，获得成熟胚从脱分化到再分化以及形成再生苗的系统为：愈伤组织诱导培养基为MS+2.0mg·L^-12,4-D+200mg·L^-1CH+100mg·L^-1MI+250mg·L^-1Glu，分化和植株再生培养基为MS+10mg·L^-1ZT+0.1mg·L^-1IAA，生根培养基为1/2MS；以上所有培养基均添加30g·L^-1蔗糖，琼脂粉8.5g·L^-1，PH5.8，在121℃下经1.1kg/cm²高压湿热灭菌20min；

（3）成熟胚的处理和诱导：取步骤（1）中消毒并低温处理好的种子，不去掉胚乳，将胚纵向全切但胚乳不完全切开，置于诱导培养基，直径6cm的培养皿，平均每皿接种20个，25℃暗培养，在培养皿上标明品种、培养基、日期和接种外植体数，培养10d后统计出愈率，挑选胚性愈伤组织继代，每周继代一次，继代四次后转入分化培养基进行光照培养，光强2000Lux，每天光照16h，培养温度为25℃，每15d继代一次，30d后统计愈伤组织分化率及出苗率，待分化苗长至3-4cm时接入生根培养基进行生根培养，30d后统计植株生根率；

（4）组培苗的管理：

待试管苗的根长4-5cm，生长一个月后将其炼苗培养，炼苗营养土为经高压蒸汽灭菌后的泥炭土、蛭石和珍珠岩，其泥炭土：蛭石：珍珠岩的质量比为6:3:1，炼苗培养2周后将苗移栽至田间，定期管理，直至植株成熟收获；