[发明专利]基于DPO引物的实时荧光PCR检测屎肠球菌的DPO引物、方法及试剂盒

说明书

本发明公开了一种检测屎肠球菌的试剂盒及方法，属于PCR检测领域。本发明的试剂盒包括用于检测屎肠球菌特异性引物其核苷酸序列如SEQ ID NO.1‑2所示。本试剂盒具有检测准确，灵敏度高，特异性强，简便快速的特点，具有良好的标本检测能力。为快速，准确检测屎肠球菌提供了新的途径。

技术领域

本发明涉及菌株检测领域，特别涉及检测样品中屎肠球菌或者含有屎肠球菌DNA的方法以及用于该方法的引物、含有该引物的组合物和试剂盒。

背景技术

屎肠球菌(Enterococcus Faecium)是一种常见的病原菌。目前屎肠球菌的检测主要依靠传统生理生化和分子生物学方法进行。传统生理生化耗时耗力，不能满足实际检测的需要。基于特异性引物的PCR的方法具备快速、准确、低成本的优点，目前被广泛用于转基因、食源性微生物、医学病原菌等方面的检测。目前PCR法已经被应用于屎肠球菌的检测，但普通PCR需要凝胶电泳判断结果，耗时耗力。另外，而不同实验室之间由于仪器、人员等差异，可能会无法精确重复出试验的各项条件，导致检测特异性受到影响，可能照成误判。

SYBR Green I是一种小分子DNA染料，游离时不会发射任何荧光信号，但当与双链DNA特异地结合时，荧光染料掺入DNA双链，发射出强烈的荧光信号，同时PCR产物的特异性可以用熔解曲线分析进一步确认，利用SYBR Green I这一特性建立的实时荧光PCR在植物病原菌检测方面已广泛应用。DPO(Dual priming oligonucleotide)引物技术的主要原理为其引物包含两个各自独立的特异性引物区域，5′端序列由18-25个碱基组成并与靶基因序列配对，3′端序列由6-12个碱基用来引导PCR反应的特异性延伸，这两段独立的特异性区域利用寡聚次黄嘌呤(Inosine，I)进行连接，由于次黄嘌呤比一般碱基的退火温度低，在退火时寡聚次黄嘌呤形成类似泡状的结构，从而使5′和3′区域形两个独立功能的双特异性引物结构，并且研究表明5′和3′引物区域中任何有3个及以上碱基的错配，PCR反应将不能进行。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种特异性强、灵敏度高、具备定量能力、通用性和实用性强的基于DPO引物的实时荧光PCR用于检测屎肠球菌方法，本发明还提供了用于该方法的DPO引物和含有该DPO引物的试剂盒。

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：

基于DPO引物的实时荧光PCR检测屎肠球菌的DPO引物，

所述DPO引物上游引物EF-DPO-F设为SEQ ID NO.1，5′-GGCGGACATGCTAACCATTCAIIIIICTGGGAAATC-3′，下游引物EF-DPO-R设为SEQ ID NO.2，5′-CCATCAATGGAGAATCTTGATTTGIIIIIGAGGTAATAGC-3′，其中I碱基为次黄嘌呤。

一种检测样品中屎肠球菌的方法，该方法包括如下步骤：

(1)待测细菌样品基因组DNA的提取；

(2)实时荧光PCR反应：以含有DNA的样品为模板与DPO引物进行实时荧光PCR反应，所述DPO引物为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；

(2)判断待检样品。

所述实时荧光PCR反应的反应体系优选如下：

所述实时荧光PCR反应的程序如下：95℃预变性30s、95℃变性5s、50-60℃退火30s、72℃延伸30s，35个循环。优选的，所述的退火温度为55℃。

一种基于DPO引物或至少包含DPO引物的细菌样品检测试剂盒。