[发明专利]一种复苏脂肪间充质干细胞的方法

说明书

本发明涉及生物技术领域，公开了一种复苏脂肪间充质干细胞的方法。该方法将传代至P3‑P5代的脂肪间充质干细胞用完全培养基培养后，再用无血清的DMEM/F12培养基培养，分别在培养24h、48h、72h时收集培养基上清，将各上清离心后再取上清混合，获得条件培养基；将冻存的脂肪间充质干细胞解冻，并加入到条件培养基中离心去上清，然后再次加入条件培养基重悬并培养至细胞融合度达到要求。本发明以培养过脂肪间充质干细胞的培养基上清为复苏时的培养基，替代现有方法中普遍采用的间充质干细胞完全培养基，依靠其中包含的多种细胞在增殖过程中分泌的活性物质来促进复苏后的脂肪间充质干细胞的生长，进而提高其活力。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体的说是涉及一种复苏脂肪间充质干细胞的方法。

背景技术

间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSC)是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层，属于多能干细胞，MSC最初在骨髓中发现，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。如间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。

脂肪间充质干细胞是来源于成体脂肪的间充质干细胞，与脐带、骨髓间充质干细胞一样，其具有较强的自我更新及多向分化潜能。间充质干细胞在分离培养后需要通过低温冷冻保存，在使用时再经过复苏进行组织器官损伤修复。

文献《人脂肪间充质干细胞的分离培养及冻存前后生物学变化》(中国神经免疫学和神经病学杂志2，013年7月，第20卷第4期)记载了当前复苏脂肪间充质干细胞的普遍方法：

6个月后从液氮中取出细胞立即置于38℃-40℃水浴锅中迅速融化后转移至预先装有培养液的离心管中以300g离心5min，用ADSCs完全培养基重悬细胞转移至培养瓶中常规培养，ADSCs完全培养基为含10％体积分数胎牛血清的低糖DMEM。

虽然上述复苏的方法比较简单、快捷，但是该方法复苏后的细胞活力偏低，不利于后续的进行组织器官损伤修复等临床应用。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种复苏脂肪间充质干细胞的方法，使得所述方法能够提高复苏后脂肪间充质干细胞的活力，并且仍然保持可以分化为成骨细胞、成脂细胞的能力。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种复苏脂肪间充质干细胞的方法，包括：

步骤1、将传代至P3-P5代的脂肪间充质干细胞先用间充质干细胞完全培养基培养后，再用无血清的DMEM/F12培养基培养，分别在培养24h、48h、72h时收集培养基上清，将各时间段上清离心后再取上清混合，获得条件培养基；

步骤2、将冻存的脂肪间充质干细胞解冻，并加入到步骤1收集的条件培养基中离心去上清，然后再次加入条件培养基重悬并培养至细胞融合度达到要求。

针对现有方法复苏冻存的脂肪间充质干细胞后细胞活力不高的问题，本发明在复苏时不采用传统方法中惯用的商业培养基(间充质干细胞完全培养基)进行复苏，而是采用培养过脂肪间充质干细胞的条件培养基来进行复苏，可显著改善复苏后细胞活力不高的现象。本发明发现利用条件培养液可有效提高复苏细胞或组织的活力，而且不同来源的条件培养液对不同细胞、组织的活力有不同的促进或抑制作用。

其中，作为优选，步骤1为：