[发明专利]一种壬基酚同分异构体混合物的单克隆抗体的制备方法

说明书

本发明公开了一种壬基酚同分异构体混合物的单克隆抗体的制备方法，将NP结构类似物与载体蛋白的偶联物作为完全抗原免疫小鼠获得抗NP同分异构体混合物的单克隆抗体。采用本发明的方法获得的单克隆抗体，其特异性好，且灵敏度高，适用范围广，特别适用于NP含量的检测，具有良好的应用前景。

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体地说，是关于一种壬基酚同分异构体混合物的单克隆抗体的制备方法。

背景技术

壬基酚(NP)是一种重要的化工原料和化学合成中间体，同时也是一种重要的环境内分泌干扰物，为淡黄色或无色液体，稍带苯酚气味，相对分子质量为220.24，不溶于水，溶于二甲基亚砜、甲醇或丙酮等有机溶剂，具有较强的疏水性，在环境和纺织物中，其由非离子表面活性剂壬基酚聚氧乙烯醚(NPnEO，n表示乙烷基的数目，为1-20)降解而来。不仅难以降解，而且具有较强的雌激素效应和生物毒性。对藻类、林蛙蝌蚪、斑马鱼等水生生物的性别分化和繁殖产生重大影响，并通过生物链的累积对人类健康产生潜在危害。因此，部分国家和地区对环境和纺织物中的NP含量作出了严格限制：我国在2011年初发布的《中国严格限制进出口的有毒化学品目录》中首次将NP列为禁止进出口的物质；加拿大环境保护法将NP列为第二大优先控制的污染物；美国环保局提出在淡水中NP含量不应高于6.6μg/L，在咸水中不应高于1.7μg/L；欧盟早在2003年正式颁布REACH法规要求NP作为成品或原料，其浓度等于或大1000mg/kg时，不得在市场上销售或使用；瑞典于2013年提交了相应的REACH法规附件XV卷宗，其指出在限制条款生效60个月后，如果产品中含有NP和NPEO的单一浓度或浓度和等于或高于100mg/kg，则这些纺织品将不得投放市场。

NP由苯酚基团和壬烷基链组成。由于壬烷基链可以与酚羟基的邻位和对位两个连接位点连接以及壬烷基链自身直链和支链的多样性，导致了壬基酚具有多种同分异构体。其中对位NP(4-NP)占NP的90-93％，而邻位NP(2-NP)只占NP的3-6％。通过气相色谱-质谱法研究发现，4-NP具有21种同分异构体(表一)，各同分异构体所占比例不同。环境和纺织物中的NP是多种同分异构体的混合物，给NP含量的检测带来众多困难。

表一 部分壬基酚同分异构体

NP的定量检测技术的研究具有较强的实用价值。纺织物中NP的检测方法也越趋多样化，较为成熟的方法是高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱-质谱联用法(LC-MS)、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)等传统仪器检测方法。这些方法较为费时、费力且对仪器要求较高。近些年来，众多免疫学检测方法被用于对NP含量的检测，其中最常见的是酶联免疫吸附法(ELISA)，免疫学方法通常具有方便、快捷和高灵敏度等特点。而基于免疫学或分子材料的其他方法也开始陆续出现，如化学发光免疫检测法、生物传感器免疫分析法、超临界流体色谱法、分子印迹法等。其中最常用的方法是HPLC和GC-MS，而酶联免疫吸附法近年来得到广大研究者的青睐。而目前市场上的单克隆抗体仅识别九碳直链NP或对九碳支链NP识别较差，因此制备对整个NP同分异构体混合物具有高亲和力的单克隆抗体的显得尤其重要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种壬基酚同分异构体混合物的单克隆抗体的制备方法，以克服现有技术所存在的上述缺点和不足。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种壬基酚同分异构体混合物的单克隆抗体的制备方法，将NP结构类似物与载体蛋白的偶联物作为完全抗原免疫小鼠获得抗NP同分异构体混合物的单克隆抗体。

根据本发明，所述方法包括如下步骤：

步骤一、将NP结构类似物与载体蛋白的偶联物作为完全抗原免疫小鼠；

步骤二、将被免疫动物的脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合；