[发明专利]一种基于虚拟波矢调制的荧光超分辨显微装置及方法

说明书

本发明公开了一种基于虚拟波矢调制的荧光超分辨显微方法，当用激发光扫描物体的某一点时，用探测器阵列记录到该点在像面上成的艾里斑的光强信息，通过对其加载不同的数字图样可对该阵列信息进行虚拟波矢调制，再将阵列的所有点光强相加作为该扫描点的图像信息；原本被成像系统带宽所截止的样品信息的高频成分被编码于调制后的图像信息中；对样品二维扫描后，得到物体经过虚拟波矢调制后的图像；然后通过迭代算法从调制后的图像中重构出物体的超分辨图像。本发明还公开了一种基于虚拟波矢调制的荧光超分辨显微装置。本发明采用探测器阵列，通过虚拟波矢调制的方法除了可获得同等的背景噪声的抑制效果，还可获得了更高的横向分辨率。

技术领域

本发明属于共聚焦显微领域，特别涉及一种基于虚拟波矢调制的荧光超分辨显微方法及装置。

背景技术

共聚焦显微镜利用激光束经光学系统形成的点光源对样品内物镜焦平面的每一点进行扫描。样品上的被照射点，在探测针孔处成像，而焦平面以外的点不会在探测针孔处成像。样品上被照射点的图像信息由探测针孔后的光电探测器逐点接收，迅速在计算机监视屏上形成荧光图像。

例如，公开号为CN102830102A的专利文献提供的一种基于空心聚焦光斑激发的共聚焦显微方法，激光光束经位相编码后转换为圆偏振光；2)将所述圆偏振光通过显微物镜聚焦到待测样品上形成空心聚焦光斑并激发荧光；对所述待测样品的表面进行扫描并收集激发荧光，获取不同位置的光强度信息，并计算得到相应的显微图像。

但根据衍射理论，显微镜的分辨能力与波长和数值孔径有关，减小波长和增大数值孔径都能提高分辨率，但都无法突破衍射极限，不能真正大幅度地提高分辨率。

从1990年起，荧光超分辨显微镜被广泛应用在生物细胞成像中，包括受激辐射损耗显微镜(STED)、荧光辐射差分显微镜(FED)、光敏定位显微镜(PALM)、随机光学重构显微镜(STORM)和结构光照明显微镜(SIM)。这些荧光超分辨显微方法都能实现超分辨成像，但同时存在三大类问题：(1)有限的荧光标记物质；(2)噪声及像差；(3)低光学切片能力。

发明内容

本发明在共聚焦显微镜的基础上，提出了一种基于虚拟波矢调制的荧光超分辨显微方法及装置，在通用的共聚焦显微镜装置基础上，用一个探测器阵列代替传统的点探测器，将探测器阵列置于物方焦平面来接受样品的图像信息。当用激发光扫描物体的某一点时，用探测器阵列记录到该点在像面上成的艾里斑的光强信息，通过对其加载不同的数字图样可对该阵列信息进行虚拟波矢调制，再将阵列的所有点光强相加作为该扫描点的图像信息。由此，原本被成像系统带宽所截止的样品信息的高频成分被编码于调制后的图像信息中。对样品二维扫描后，得到物体经过虚拟波矢调制后的图像。本发明设计了一种独特的迭代算法，从调制后的图像中重构出物体的超分辨图像，并复原出激发光路的光学传递函数。

本发明的具体技术方案如下：

一种基于虚拟波矢调制的荧光超分辨显微方法，针对荧光样品(被两类荧光蛋白标记)包括以下步骤：

(1)激光器发出激发光束，首先经第一透镜准直，经第一反射镜反射、第一二色镜反射后进入扫描振镜系统；经扫描振镜系统导向的激发光再经扫描镜后在聚焦于扫描镜后焦面；聚焦于扫描镜后焦面的激发光再经过场镜和显微物镜聚焦于物体上的一点；扫描振镜系统扫描时候，在扫描镜的后焦面上形成扫描区域，场镜和显微物镜共同构成一个成像系统扫描镜后焦面上的扫描区域成像于物体上；

(2)当激光聚焦于所述荧光样品的某一点时，该点被激发光激发发射荧光被显微物镜收集，再经过场镜、扫描镜后返回入扫描系统；经过扫描系统返回来的荧光再经第一二色镜透射后，经滤波片滤除散射光，再经放大系统放大，将样品上该点发出的艾里斑成像于探测器阵列；