[发明专利]一种葡聚糖外切酶II基因的密码子优化及其毕赤酵母表达系统

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及里氏木霉葡聚糖外切酶II(CBHII)基因密码子优化及pPIC9K-cbh2表达载体的构建。

背景技术

纤维素酶是一类多组分酶的总称，能够将难以被生物利用的纤维素水解为利于被生物利用的葡萄糖，因此被认为是潜力巨大的酶制剂之一。纤维素酶属于糖苷水解酶，能够降解纤维素的纤维素酶系至少包括三类组分：内切型-β-葡聚糖酶(endo-1,4-β-D-glucanase,EC3.2.1.4)，外切型-β-葡聚糖酶(exo-1,4-β-D-glucanase,EC3.2.1.91)与β-葡萄糖苷酶(β-1,4-D-glucosidase,EC3.2.1.21)。而纤维素主体由吡喃葡萄糖构成，并以β-1,4糖苷键连接，形成大分子线性多聚物，单体为纤维二糖分子，主要由结构稳定、微生物难以降解的结晶区和结构疏松、微生物容易降解的非结晶区两部分构成。

纤维素酶系中的酶组分并不是单独作用于纤维素从而水解纤维素的，它们通过相互协同作用实现水解功能，其中内切型-β-葡聚糖酶作用于非结晶区，水解β-1,4糖苷键，可将线性纤维素多聚物截断生成大量纤维素小分子；外切型-β-葡聚糖酶水解1,4-β-D-糖苷键，作用于线性纤维素多聚物末端，生成纤维二糖分子；β-葡萄糖苷酶则将纤维二糖水解成为葡萄糖。通过纤维素酶复合酶组分相互协同作用，可以将地球上最丰富的生物高聚物—纤维素，转化为微生物可以轻易利用的葡萄糖，通过发酵产生生物燃料，用以缓解目前能源短缺问题。

纤维素酶来源广泛，产生纤维素酶的生物包括昆虫、软体动物、原生动物、细菌和真菌。然而，这些自产酶天生具有一定的配比缺陷，比如：里氏木霉的纤维素酶中CBHII和β-葡萄糖苷酶产量不足，而黑曲霉中各酶的分泌高峰期不同，这些因素对纤维素水解有限制作用。另外，不同木质纤维素材料中纤维素、半纤维素以及木质素的比例有显著差异，导致同一类商业纤维素酶制剂或自产酶并不能发挥最佳的酶解效果。所以，优化定制纤维素酶，使各组分达到最佳配比，才能在最少酶用量时获得最优的水解效果。因此，为了优化定制纤维素酶，获得纤维素酶单酶组分十分关键。

近些年来，异源表达纤维素酶基因获得单酶组分是研究热点。毕赤酵母(Pichiapastoris)可以实现翻译后修饰作用，如糖基化、二硫键形成，使蛋白可以进行正确折叠，并获得有活性的目标蛋白，另外，毕赤酵母并不产生内源性木质纤维素酶组分，且胞外蛋白成分并不复杂，重组毕赤酵母菌发酵上清液甚至可以不经过纯化直接作为单酶制剂进行使用，因此，以毕赤酵母作为宿主菌实现纤维素酶组分CBHII异源表达以获得CBHII组分。

发明内容

本发明目的在于提供一种优化的里氏木霉CBHII基因，优化后的序列GC含量由55.4％降低为41.5％，并构建pPIC9K-cbh2表达载体，以获得稳定高效的表达转化子。

本发明提供的CBHII基因密码子优化及其毕赤酵母表达系统具体步骤如下：

1、密码子偏向性优化：

本发明对CBHII实现密码子优化，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。

SEQIDNO.1：

密码子优化前CBHII氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。

SEQIDNO.2：

本发明利用GeneDesigner(DNA2.0,MenloPark,CA,USA)实现对SEQIDNO.1所示的CBHII核苷酸序列密码子偏向性优化，优化后核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。

SEQIDNO.3

经过密码子优化后，CBHII氨基酸序列与SEQIDNO.2相同。

2、表达载体构建：

以质粒pPIC9K作为载体，将优化后的CBHII基因插入启动子AOX1下游，5’端酶切位点为EcoRI，3’端酶切位点为NotI，构建pPIC9K-cbh2表达载体。

3、获取重组菌株：

以SacI作为pPIC9K-cbh2表达载体线性化位点，实现表达载体线性化，通过电转化转入毕赤酵母。

4、优化诱导产酶条件：

以BMMY作为产酶培养基，优化诱导剂量与培养基中磷酸钾缓冲液pH值，实现CBHII稳定高效产酶。

本发明有益效果：