[发明专利]结核分枝杆菌KatG突变基因及其用途

说明书

技术领域

本发明涉及一种结核分枝杆菌KatG突变基因，以及用于检测导致结核分枝杆菌异烟肼耐药基因KatG突变c.906C>A的试剂盒，属于结核病耐药基因突变检测技术领域。

背景技术

结核分枝杆菌引发常见的慢性呼吸道传播疾病---结核病，主要累及脏器为肺，此外还会侵犯皮肤、骨骼等全身多个组织和器官，多集中在15-35岁的青壮年发病。核病全球流行，但发展中国家患病人数相对较多，随着结核药物的应用和生活及医疗水平的提高，结核病的发病率有所降低。近年，抗生素滥用、环境污染和艾滋病等原因导致的结核发病率和耐药率均有所增加。根据世界卫生组织（WorldHealthOrganization，WHO）2008年报道，全球结核病的总耐药率高达20%，耐多药率约为5.3%，而我国调查数据显示中国肺结核耐多药率为8.3%，可见我国耐药结核患者的预防和治疗工作刻不容缓。

自1952年发现异烟肼具有全效能杀结核分枝杆菌复合物以来，无论单独或联合应用该药对患者进行治疗，异烟肼（INH）都是抗结核一线药物。目前研究表明KatG基因突变是常见的导致异烟肼耐药的原因之一。KatG基因编码结核菌过氧化氢-过氧化物酶，该酶可激活INH为INH自由基，INH自由基与辅酶I（Nicotinamideadeninedinucleotide，NAD⁺）形成共价化合物，抑制烯酰基乙酰载体蛋白还原酶（该酶由InhA基因编码）的功能，进而阻止细胞壁分枝菌酸的合成，导致病原菌死亡。若KatG基因发生突变，则会阻止INH转化为活性物质从而失去作用，导致结核菌产生抗药性。目前报道的KatG基因的常见突变为315位（丝氨酸突变为苏氨酸）和463位（精氨酸突变为亮氨酸）的氨基酸改变，不同国家报道的数据表明，超过60%的KatG基因突变发生在氨基酸315位点。同时发现KatG基因存在热点突变区域，在315位氨基酸附近，还存在多个氨基酸位点的突变。我国对结核杆菌耐异烟肼的KatG基因的研究也较多，但是多数研究仅针对315和463两个常见突变位点进行检测，这可能导致一些其他突变热点区的突变位点在检测时被忽视，从而影响临床诊断。

由于全球获得性免疫缺陷（AIDS）患者数量的增多，结核作为机会性致病菌，其发病率也有逐年增多的趋势。因此对结核患者早期进行诊断，并且对耐药结核患者的具体耐药机制进行确诊，提前调整对该类患者的临床用药，将大大缩短临床诊断时间，有助于早期发现其耐药机制，特别是对一些耐多药患者进行突变热点的基因诊断，从而采取有效的临床治疗措施，将大大提高该类患者的治愈率。异烟肼是临床常用抗结核药物之一，也是一线常规用药，因此对结核杆菌耐异烟肼KatG基因的突变热点区进行基因检测，将有利于临床快速诊断和治疗。

经文献检索，未见与本发明检测突变位点相同的公开报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测结核分枝杆菌KatG突变基因的方法，该结核分枝杆菌KatG突变基因具有c.906C>A突变位点，其核苷酸序列如SEQIDNO：3所示。

本发明另一目的是提供用于检测结核分枝杆菌KatG突变基因的试剂盒，该试剂盒包括用于检测结核分枝杆菌KatG基因c.906C>A突变的试剂。

所述试剂盒包括核苷酸序列如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示的引物。

本发明通过检测来自耐异烟肼结核菌株的样本中是否存在KatG基因的c.906C>A突变，从而判断该患者耐异烟肼药物的耐药分子机制；其中c.906C>A突变位点为KatG基因的突变，该突变导致KatG基因第302位的丝氨酸（Ser）突变为精氨酸（Arg），这个氨基酸的改变，影响了药物异烟肼转化为活性物质成分，发挥其抗结核分枝杆菌的作用，从而使该菌株产生耐药。

发明人用候选基因筛查的方法，在中国33株耐异烟肼结核菌株中进行检测，在一株耐药结核菌种发现与耐异烟肼相关的KatG基因新突变c.906C>A；该突变的频率为3%，这说明在耐异烟肼的结核菌株中，KatG基因突变c.906C>A具有一定的发生频率，因此Kat基因突变c.906C>A可以作为临床异烟肼耐药菌株耐药分子机制的诊断依据，并且目前，在国际和国内均未见该突变的报道。

本发明用于检测KatG基因突变c.906C>A的试剂盒，包括用于检测KatG基因的突变c.906C>A所需的常规试剂和能选用的用于扩增KatG基因的试剂和PCR引物。

用于检测KatG基因突变c.906C>A的试剂盒，包括以下一种或几种试剂的组合：