[发明专利]一种托品酰胺人工抗原的制备方法

说明书

本发明提供了一种托品酰胺人工抗原的制备方法，第一步为半抗原的制备及检测：以托品酰胺与丁二酸酐进行酰化反应得到含羧基的化合物，该化合物和甘氨酸乙酯盐酸盐经缩合反应和水解反应得到含羧基的半抗原；第二步为人工抗原的制备与检测：通过混合酸酐法使之与牛丙种球蛋白(BGG)结合制备托品酰胺的人工抗原即托品酰胺‑牛丙种球蛋白。所制备的托品酰胺人工抗原可进行动物免疫，取得相应的托品酰胺抗体，可用于托品酰胺免疫分析法的研究，为托品酰胺的检测提供更加方便快速准确的途径。

技术领域

本发明属于生物化工技术领域，具体涉及一种托品酰胺人工抗原的制备方法。

背景技术

托品酰胺(Tropicamide)又称托品卡胺或者托吡卡胺，属于抗胆碱药，有散瞳作用和睫状肌麻醉作用，具有作用快，时间短等优点，为眼科散瞳首选药，用于散瞳检查眼底，验光配镜，治疗虹膜睫状体炎和近视等。化学名为N-乙基-N-(4-吡啶甲基)-alpha-羟甲基-苯乙酰胺，其结构式为：

托品酰胺是一种副交感神经阻断剂，通常用来生产眼药水，但是，近几年，在俄罗斯和意大利，托品酰胺被通过自行静脉注射来达到娱乐的目的。其具有生理依赖性，心里依赖性和耐受性，滥用会导致包括口齿不清，持续性的瞳孔放大，无意识，幻觉，肾疼，烦躁不安，白日梦，过高热，颤抖，自杀倾向，抽搐，精神运动性激动，心动过速和头痛等症状。并且托品酰胺与其他毒品混用，可以增强其药效，所以它也引来了越来越多的吸毒者的青睐，因此必须严格管理。

目前，国内还没有对托品酰胺滥用的报道，因此针对托品酰胺的的检测很少，对于小分子的检测一般主要依靠高效液相色谱法(HPLC)，气相色谱(GC)，薄层色谱(TLC)，质谱(MS)等，但是存在仪器昂贵，检测费时，并且需要专业技术人员进行操作，不能达到现代检测对快速，准确的要求。而免疫分析法可以弥补以上所有缺点，免疫分析法是一种利用抗原抗体特异性结合反应检测各种物质(药物、激素、蛋白质、微生物等)的分析方法,该方法的前提就是需要提供特异性的抗原和抗体。因此有必要提供一种有效的托品酰胺人工抗原的制备方法，制备的托品酰胺人工抗原可用于免疫制备具有特异性的托品酰胺抗体，进一步用于检测。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷与不足，提供一种托品酰胺人工抗原的制备方法，所制备的托品酰胺人工抗原可进行动物免疫，取得相应的托品酰胺抗体，可用于各种托品酰胺类免疫分析法的研究，为托品酰胺的检测提供更加方便快速准确的途径。

一种托品酰胺人工抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)制备人工半抗原：

(a)将托品酰胺与丁二酸酐以摩尔比为1:1.5加入单口圆底烧瓶中，用吡啶溶解，100℃油浴下，搅拌回流20小时；结束反应，冷却至室温，减压转干，并用少量乙醇共沸，浓缩后，经薄层色谱法分离得微黄色固体产物Ⅰ；薄层层析：层析液以体积比计为95％乙醇:1,4-二氧六环:二氯甲烷:氨水＝8:1:10:1，产物Rf＝0.3；

(b)将产物Ⅰ与甘氨酸乙酯盐酸盐和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐以摩尔比为1:1.15:2溶于吡啶中，氮气气氛中，室温搅拌反应18小时；反应结束，转干，用少量乙醇共沸，得到的残渣加入PBS，用氯仿萃取两次，得到的有机相再用双蒸水洗，有机相用无水硫酸镁干燥，过滤，转干得黄色油状物Ⅱ；薄层层析：层析液以体积比计为95％乙醇:1,4-二氧六环:二氯甲烷:氨水＝8:1:10:1，产物Rf＝0.7；

(c)将黄色油状物Ⅱ溶于四氢呋喃和甲醇中，加入1N的氢氧化钠水溶液，室温搅拌反应4小时；结束反应，蒸干溶剂，用1N的盐酸调pH＝3，用乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，用无水硫酸镁干燥，过滤，转干得黄色油状残渣，经薄层色谱分离得黄色油状物Ⅲ即托品酰胺半抗原；薄层层析：层析液以体积比计为95％乙醇:1,4-二氧六环:二氯甲烷:氨水＝8:1:10:1，产物Rf＝0.2；