[发明专利]一种农杆菌介导外植体遗传转化方法

权利要求书

1.一种农杆菌介导外植体遗传转化方法，包括：1）农杆菌的活化、2）农杆菌侵染外植体、3）农杆菌与外植体共培养、4）外植体诱导和筛选分化，其特征在于：所述农杆菌与外植体共培养步骤的操作为：在固体共培养基上放置灭菌滤纸将农杆菌侵染后的外植体表面菌液吸净后放置在所述灭菌滤纸上黑暗培养3~4天，培养温度22~23℃。

2.根据权利要求1所述的农杆菌介导外植体遗传转化方法，其特征在于：所述固体共培养基的制备方法为：蒸馏水加入0.7%的琼脂粉，高压灭菌后加入200uM乙酰丁香酮。

3.根据权利要求1所述的农杆菌介导外植体遗传转化方法，其特征在于：所述滤纸为WhatmanNo.1定性滤纸。

4.根据权利要求1所述的农杆菌介导外植体遗传转化方法，其特征在于：所述农杆菌活化的具体操作为：取冻存农杆菌，在冰上融化后接种于5mlYEP液体培养基中，28℃，200rpm过夜振荡培养；次日扩大培养于50ml的YEP液体培养基中，振荡培养至OD₆₀₀=0.6-0.8，离心收集菌体，重悬于侵染培养液中，侵染前加入200μM乙酰丁香酮，得活化的农杆菌悬液。

5.根据权利要求1所述的农杆菌介导外植体遗传转化方法，其特征在于：所述农杆菌侵染外植体的具体操作为：外植体与活化的农杆菌悬液混合，浸染时间为10~30min。

6.根据权利要求1所述的农杆菌介导外植体遗传转化方法，其特征在于：所述外植体诱导和筛选分化过程的具体操作为：经过共培养后的外植体用附加200~300mg/LTimentin的无菌水清洗后，以无菌滤纸吸去残留液体，于分化培养基上光照培养5-7天，转移至选择培养基上培养，待抗性芽长至1-2cm时转至生根培养基上生根，分化培养、选择培养、生根培养的条件：温度25℃，光照14h/d，光照强度1600~2000lux。

7.根据权利要求1所述的农杆菌介导外植体遗传转化方法，其特征在于：所述外植体诱导和筛选分化过程的具体操作为：经过共培养后的外植体用附加250mg/LTimentin的无菌水洗3-4遍，再用无菌滤纸吸去残留液体，于诱导培养基上黑暗培养3-4周，然后转移至选择培养基上培养，待抗性芽长至1-2cm时转至生根培养基上生根，所述诱导培养、选择培养、生根培养的条件：温度25℃，光照16h/d，光照强度1600~2000lux。

8.根据权利要求1所述的农杆菌介导外植体遗传转化方法，其特征在于：所述外植体为叶片、叶柄、茎、幼胚、成熟胚。

9.根据权利要求1所述的农杆菌介导外植体遗传转化方法，其特征在于：所述农杆菌菌株为EHA105、LBA4404、GV3101、AGL1。