[发明专利]乙型肝炎病毒八种基因亚型的鉴别检测方法及试剂盒

说明书

本发明公开了一种乙型肝炎病毒八种基因亚型的鉴别检测方法及试剂盒，其利用多重聚合酶链反应（PCR）结合液相芯片来快速定性和定量鉴别检测乙型肝炎病毒A~H八种基因亚型，选用了对各自扩增的病毒特异序列都有很高灵敏度的引物对，并设计了碱基成分合理的探针，提高了检测的灵敏度。本发明的技术方案在一次试验中可以鉴别包括乙型肝炎病毒的A~H八种基因亚型，具有通量大，特异性及灵敏度高，结果稳定，重复性好，操作简单，检测速度快的优点。

技术领域

本发明属于生物芯片和诊断试剂技术领域，涉及一种针对乙型肝炎病毒八种基因亚型的鉴别检测方法及引物和探针，具体是一种采用基于微球的液相芯片技术用于快速对乙型肝炎病毒八种基因亚型进行检测的方法。

背景技术

乙型病毒性肝炎是长期困扰全球医学界的难题，是急慢性肝炎、肝硬化、肝癌的重要致病因子之一，也是全世界最严重的公共卫生问题之一 。据WTO报告，全球 60 多亿人口中，有大约30亿人口生活在乙型肝炎病毒（HBV）高流行地区，超过20 亿人感染过HBV，其中慢性感染者超过3.5亿。我国每年的乙肝发病率在6000万人次以上，是一个乙型病毒性肝炎发病大国。在中国、东南亚和非洲等国家和地区，有约50％的肝硬化和 70－90％的肝癌，是由慢性 HBV 感染引起，而感染了 HBV 变异体的 HBV 携带者有7－30% 。

目前根据基因序列的核苷酸差异将HBV分为A～H 8种基因型别，按照全基因序列核苷酸差异≥8%或其S基因序列核苷酸差异≥4%的差异度判定为不同型别，同一基因型满足序列差异≤5.6%。近年来的研究表明由基因突变导致的不同的HBV 基因型，呈地理区域性分布，且不同基因型致病性不同，基因型与乙型肝炎病情的进展、临床表现、治疗耐药、预后有密切的关系。因此，通过有效而准确的检测方法对HBV 进行早期的检测与分型，对HBV的早期治疗和术后检查具有重要的意义。

目前乙型肝炎病毒基因分型的检测方法包括基因序列测定、聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析（PCR-RFLP）、基因型特异性多引物对PCR分型（即巢式PCR法）、特异性线性探针检测法（INNO-LiPA）、PCR微板核酸分子杂交ELISA法、单克隆抗体 ELISA 法以及基因芯片。但这些方法或多或少存在一些缺陷：如基因测序分型方法虽然结果准确可靠，但过程繁琐、费时、成本高、难以推广，不适合大样本的检测，且缺乏敏感性，不能发现同一个体中两种或两种以上的HBV基因型的混合感染。PCR-RFLP对于单个核苷酸位点的多态性所导致的限制性内切酶酶切位点改变有碍内切酶消化，酶切不完全会出现复杂的条带，酶切图谱识别复杂，因而影响基因分型的可信度，且该法同样不能发现几种基因型的混合感染。巢式PCR法方法需要合成多条引物，需经两轮PCR过程，较RFLP法历时长，污染机会较大，且无法完全避免出现非特异性扩增条带而妨碍观察分型结果。INNO-LiPA存在价格昂贵、特异性稍低的不足。单克隆抗体 ELISA 法不能对血清HBsAg阴性的HBV感染进行基因分型，以及少数HBsAg无法分型。基因芯片存在成本较高、假阳性率高、不同芯片的集成度不足等缺点。PCR微板核酸分子杂交ELISA法适用于自动化程度较高的实验室。

对于分子实验室中大量样本的常规检测，研究者正致力于开发和建设以多重快速检测为目标的检测平台。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种乙型肝炎病毒八种基因亚型的鉴别检测方法及试剂盒，其利用多重聚合酶链反应（PCR）结合液相芯片来快速定性和定量检测八种乙型肝炎病毒基因亚型，特异性和灵敏度高、重复性好。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：

一种乙型肝炎病毒八种基因亚型的鉴别检测试剂盒，该试剂盒包括用于检测下列乙型肝炎病毒基因亚型的探针：