[发明专利]一种以桑枝为原料固态发酵制备1-脱氧野尻霉素的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种以桑枝为原料固态发酵制备1-脱氧野尻霉素(1-DNJ)的方法，属药品、保健品领域。

背景技术

1-脱氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin,DNJ）是一种存在于桑树及其他植物和微生物中的多羟基哌啶生物碱，化学名称为3,4,5-三羟基-2-羟甲基四氢吡啶，分子式为C₆H₁₃O₄，分子量为163。

1-DNJ具有对α-葡萄糖苷酶的抑制作用、是降血糖、治疗糖尿病的有效成分，此外还具有抗病毒、抗肿瘤转移等药理活性。

1-DNJ来源于天然产物、生物合成、化学合成，其制备方法主要有以下几种：

一种是从植物中提取。在桑树既一些微生物中含有少量的1-脱氧野尻霉素（不足0.1%），用此工艺制备1-DNJ，因1-DNJ热稳定性差，产品含量低，实际意义不大。

一种是生物合成，但目前生物合成机制尚不清楚，给产品的分离纯化带来了一定的困难，目前较少用此方法进行1-DNJ的生产。

由于DNJ的人工合成目前还处在试验研究阶段，合成路线较长、步骤繁琐、技术要求高、得到的DNJ产量却较低，故不能实现工业化的生产，有待进一步改善。

目前公开的以桑叶为原料制备1-脱氧野尻霉素制备的方法。一种是酸水提取制备1-脱氧野尻霉素的工艺（专利号：CN102276515A），此法对设备抗腐蚀能力要求很高。CN101020655A公开的方法是以干燥桑叶为原料，通过醇液提取，加入酸酸化后，过阳离子交换树脂，再使用碱性醇液进行洗脱，经干燥制成桑叶提取物初品，过程简单，但提取物中1-脱氧野尻霉素的含量仅为10%左右。CN10134586A公开的方法是以桑叶粗提物为原料（含DNJ40%以上），水溶后，直接过阳离子树脂，再使用洗脱液进行洗脱并分步收集，最后经多次重结晶得到纯度较高的产品，由于重结晶使用的混合溶剂不易分离回收利用，所以生产成本较高。CN101671294A公开的方法不仅分离得到了DNJ产品，同时还从桑叶中得到了另一产品桑叶黄酮，具体是为以干燥桑叶为原料，使用乙醇进行提取，离心过滤，加入絮凝剂絮凝沉淀；滤液依次通过大孔吸附树脂与阳离子树脂后进行喷雾，即得DNJ产品，此方法由于工艺较长，加上使用絮凝沉淀方式，损失较大，其最终的得率也较低，这是此方法最大的不足之处。

发明内容

本发明的目的是提供一种以桑枝为原料固态发酵制备1-脱氧野尻霉素(1-DNJ)的方法。通过直接以桑枝粉末为发酵底物，枯草芽孢杆菌固态发酵法生产1-脱氧野尻霉素(1-DNJ)，经过提取分离得到高纯度1-脱氧野尻霉素(1-DNJ)。此方法操作简单，得到的1-DNJ具有很高的纯度和产率。

本发明以枯草芽孢杆菌（购买自工业微生物菌种保藏管理中心（CICC），菌种编号20632），为发酵菌种，以桑枝为发酵底物，进行固态发酵。发酵过程中，枯草芽孢杆菌合成纤维素酶并将其分泌到细胞外，纤维素酶分解桑枝细胞壁，是1-DNJ释放出来，发酵产物经过提取分离得到高纯度的1-DNJ，包括以下步骤。

（1）桑枝的固态发酵：将桑枝粉末置于发酵罐中，加入桑枝总重量的40%~65%润湿水溶液润湿桑枝，所用的润湿液中含1.5%乳糖、1.5%蛋白胨、2.75%NaCl和0.55%KH₂PO₄，pH6.6~9.2，110℃灭菌20min，冷却后将枯草芽孢杆菌（BacillusSubtilis20632）接入，桑枝和枯草芽孢杆菌的用量比例为10g桑枝粉末添加2mL浓度为1×10⁹个/mL的枯草芽孢杆菌孢子悬液，混匀，搅拌，37℃发酵2~5天，得到含有1-脱氧野尻霉素(1-DNJ)的发酵产物。

（2）1-脱氧野尻霉素(1-DNJ)的提取：发酵产物烘干后，加入4~12倍60%~90%乙醇，超声波提取，合并提取液，膜滤，回收乙醇，喷雾干燥，干燥后的1-脱氧野尻霉素(1-DNJ)产品。

为了提高产率，步骤（2）（1）中，60%~90%乙醇提取过程为两次完成，每次20~180min。

本发明的优点是：工艺简单，制备过程绿色化，三废排放少，适合大规模的生产，产品品质好，1-DNJ产品收率高和纯度高。