[发明专利]一种猪肉源性成分核酸的恒温扩增检测试剂盒及检测方法

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种针对猪肉源性成分核酸的恒温扩增快速检测技术，适合对猪肉源性成分核酸的现场快速定性检测。

(二)背景技术

近年来，肉制品掺假成为社会广泛关注的食品安全问题。2013年，涉及欧洲16国的“马肉风波”震惊整个欧洲。在我国，肉类掺假掺杂事件近年来被媒体多次曝光。肉制品市场中，一些不法商家或个人为了追求自身利益而用低价劣质的肉冒充高价优质的肉，以猪肉冒充牛羊肉等，极大的损坏了消费者的利益和健康。

目前，普通PCR或实时荧光定量PCR是肉制品品种鉴别最常用的方法，普通PCR法具有耗时长，操作繁琐，灵敏度不够，容易产交叉污染等缺点。实时荧光PCR法则具有成本昂贵，耗时长，技术要求高，需要大型的仪器设备等缺点，因此其应用仍存在一定的局限性。恒温扩增技术是继PCR技术后近年发展起来的一种新的体外核酸扩增技术，本发明技术研制了恒温扩增猪肉源性成分核酸，并结合核酸试纸条显色来判定检测结果，且整个反应过程不打开反应管盖子，试纸条流动检测过程密闭，杜绝了核酸扩增产物污染外界的可能性。研究表明该猪肉源性成分核酸恒温扩增-核酸试纸条检测方法具有特异性强、敏感度高、对仪器要求简单、检测时间短等优点，所以非常适用在基层检验机构使用，同时在农贸市场的现场检测上也具有很好的应用前景。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种准确、灵敏、快速地检测猪肉源性成分核酸的恒温扩增检测试剂盒及其检测方法。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种猪肉源性成分核酸的恒温扩增检测试剂盒，所述试剂盒包括如下组成：

(1)恒温扩增反应液，包括：正向外围引物、反向外围引物、两条探针、两条交叉扩增引物、1×Thermolbuffer、MgSO₄、dNTPs溶液、BstDNA聚合酶和无菌双蒸水；其中：

所述的外围引物分别为：

所述正向外围引物为：5′-TGAAACATTGGAGTAGTCCTAC-3′(SEQIDNO.2)；

反向外围引物为：5′-AGAATCGTGTGAGGGTTG-3′(SEQIDNO.3)；所述两条探针的序列分别为：

正向5′端Biotin标记探针：5′-Biotin-GCAGGACGTAGCCTATGAA-3′(SEQIDNO.4)；

反向5′端Fitc标记探针：5′-Fitc-ACAGACCTCGTAGAATGAATCT-3′(SEQIDNO.5)；

所述两条扩增交叉引物分别为：

扩增正向引物：5′-

GCTCCTCAGAATGATATTTGTCCTCATTTACCGTTATAGCAACAGC-3′(SEQIDNO.6)；

扩增反向引物：5′-

ACTATCAGCTATCCCTTATATCGGATTTGTCGACGGAAAAGCC-3′

(SEQIDNO.7)；

(2)阳性对照：含有猪属特异性的Cytb基因片段的DNA质粒；

(3)阴性对照：无菌双蒸水。

进一步，本发明所述的1×Thermolbuffer组成为：20mM的Tris-HCl、10mM的KCl、10mM的(NH₄)₂SO₄、2mM的MgSO₄以及质量浓度为0.1％的TritonX-100，pH7.8。

进一步，本发明所述阳性对照为含有长198bp的猪属特异性的Cytb基因序列的片段，所述片段的核苷酸序列如下(SEQIDNO.1)：

GAAACATTGGAGTAGTCCTACTATTTACCGTTATAGCAACAGCCTTCATAGGCTACGTCCTGCCCTGAGGACAAATATCATTCTGAGGAGCTACGGTCATCACAAATCTACTATCAGCTATCCCTTATATCGGAACAGACCTCGTAGAATGAATCTGAGGGGGCTTTTCCGTCGACAAAGCAACCCTCACACGATTCT。

进一步，本发明所述阳性对照按如下步骤制备：