[发明专利]一种羊肉源性成分核酸的恒温扩增检测试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种羊肉源性成分核酸的恒温扩增检测试剂盒，其特征在于所述试剂 盒包括下列组成：

(1)恒温扩增反应液，包括：正向外围引物、反向外围引物、一条探针、 两条环引物、两条扩增交叉引物、1×ThermolBuffer，MgSO₄，dNTPs溶液， BstDNA聚合酶和无菌双蒸水；

所述正向外围引物为：5′-GCAAACCCACTTAACACTC-3′；

反向外围引物为：5′-AGGTCGGCTACTAGGATTC-3′；

所述两条环引物的序列分别为：

正向：5′-GCGTACGCAAATAGGAAGTATCA-3′；

反向：5′-ACATCAAAGCAACGGAGCATAA-3′；

所述两条扩增交叉引物分别为：

扩增正向引物：5′端Biotin标记

5′-GGACTCCTCCTAGTTTATTAGGGAT-CCCTCACATCAAACCTGAA-3′；

扩增反向引物：

5′-GTCCTAGTAATTATACCCCTCCTCC-ATTGACTGATTGGTCGGAAT-3′；

探针：5′端标记Fitc：5′-Fitc-TCGCCCTAATCCTCTCAATCCT-3′；

(2)阳性对照：含有羊属特异性的细胞色素b基因Cytb的DNA质粒；

(3)阴性对照：无菌双蒸水。

2.如权利要求1所述羊肉源性成分核酸的恒温扩增检测试剂盒，其特征 在于所述1×ThermolBuffer组成为：20mM的Tris-HCl、10mM的KCl、10 mM的(NH₄)₂SO₄、2mM的MgSO₄以及质量浓度为0.1％的TritonX-100， pH7.8。

3.如权利要求1所述羊肉源性成分核酸的恒温扩增检测试剂盒，其特征 在于所述阳性对照为含有长221bp的羊属特异性的Cytb基因序列的片段，所 述片段的核苷酸序列为SEQIDNO.1所示。

4.如权利要求1所述羊肉源性成分核酸的恒温扩增检测试剂盒，其特征 在于所述阳性对照按如下步骤制备：

以包含扩增区域的羊属特异性的Cytb基因片段为模板，通过两条外围引 物进行PCR扩增获得目的基因；利用PCR纯化试剂盒对PCR扩增产物进行 纯化；将纯化后的扩增产物通过T-easy质粒转染试剂盒构建完整的含有目的 基因的质粒序列，用分光光度计对所抽提的质粒定量并稀释至10个拷贝/μl， 获得阳性对照，-20℃保存。

5.如权利要求1所述羊肉源性成分核酸的恒温扩增检测试剂盒，其特征 在于所述恒温PCR扩增反应液组成为：两条外围引物各自5.7nmol，两条环 引物及探针各自11.4nmol，两条交叉引物各自22.8nmol，1×Thermolbuffer， MgSO₄为0.2μmol，dNTPs溶液各35pmol，BstDNA聚合酶8U，无菌双蒸水 组成补足至25μl。

6.一种权利要求1所述羊肉源性成分核酸的恒温扩增检测试剂盒的检测 方法，其特征在于所述检测方法为：

a)提取待检测标本DNA：剪取约米粒大小的羊肉样品，加入500μL双 蒸水后振荡15s，于95℃作用5min，离心后取上清，即获得DNA；

b)将步骤a)提取得到的DNA作为模板，加入到装有恒温扩增反应液 的PCR管中，在65℃下扩增反应30分钟；标准阳性模板加入阳性对照PCR 管中，标准阴性模板加入阴性对照PCR管中，所述标准阳性模板为含有羊属 特异性的Cytb基因片段的DNA质粒，所述标准阴性模板为无菌双蒸水；

c)将反应后的PCR管放置到核酸试纸条防污染检测装置中进行检测，2 分钟以后判读结果，当试纸条的检测线呈阳性时，说明样品中含有羊肉源性 成分核酸。