[发明专利]一种鸡肉源性成分核酸的恒温扩增检测试剂盒及检测方法

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种针对鸡肉源性成分核酸的恒温扩增快速检测技术，适合对鸡肉源性成分核酸的现场快速定性检测。

(二)背景技术

我国肉类产量逐年增加，其中鸡肉产量占据肉类总产量的13.97％。与此同时，消费者对食品质量与安全性的要求也越来越高，不法商贩、企业为获得非法利润，常以较低价的鸡肉冒充牛、羊、猪肉，严重侵害了消费者利益。这不仅涉及经济、营养价值和食品安全等问题，更直接影响消费者的健康，尤其是对某些食物过敏的消费者。为维护广大消费者合法权益，稳定市场秩序，对动物性食品进行种源的鉴定显得十分必要。

目前，在动物种源的定性检测的常规检测方法，如电泳、免疫学技术、光谱技术等存在很大缺陷，如灵敏度低、周期长、费时费力等，因此其应用仍存在一定的局限性。本发明技术研制了恒温扩增鸡肉源性成分核酸，并结合核酸试纸条显色来判定检测结果，且整个反应过程不打开反应管盖子，试纸条流动检测过程密闭，杜绝了核酸扩增产物污染外界的可能性。研究表明该鸡肉源性成分核酸的恒温扩增-核酸试纸条检测方法具有特异性强、敏感度高、对仪器要求简单、检测时间短等优点，所以非常适用在基层检验机构使用，同时在农贸市场的现场检测上也具有很好的应用前景。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种准确、灵敏、快速地检测鸡肉源性成分核酸的恒温扩增检测试剂盒及其检测方法。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种鸡肉源性成分核酸的恒温扩增检测试剂盒，所述试剂盒包括如下组成：

(1)恒温扩增反应液，包括：正向外围引物、反向外围引物、两条探针、两条交叉扩增引物、1×Thermolbuffer、MgSO₄、dNTPs溶液、BstDNA聚合酶和无菌双蒸水；其中：

所述的外围引物分别为：

正向外围引物为：5′-TCTCCCATGGGGCCAAAT-3′(SEQIDNO.2)；

反向外围引物为：5′-TAGGAAGGTGAGGTGGATGA-3′(SEQIDNO.3)；

所述两条探针的序列分别为：

正向5′端Biotin标记探针：5′-Biotin-GTCCAATGTAGGGAATTGCTG-3′(SEQIDNO.4)；

反向5′端Fitc标记探针：5′-Fitc-GTAAGGCGAAGAATCGGGA-3′(SEQIDNO.5)；

所述两条扩增交叉引物分别为：

扩增正向引物：

5′-TCCCCCTCAGGCTCACTCTACTCTGAGGGGCCACCGTTAT-3′(SEQIDNO.6)；

扩增反向引物：

5′-TTCAGTCGACAACCCAACCCTTCGATTGCAAAGGGGAGGAG-3′(SEQIDNO.7)；

(2)阳性对照：含有鸡属特异性的细胞色素b基因(Cytb基因)片段的DNA质粒；

(3)阴性对照：无菌双蒸水。

进一步，本发明所述的1×Thermolbuffer组成为：20mM的Tris-HCl、10mM的KCl、10mM的(NH₄)₂SO₄、2mM的MgSO₄以及质量浓度为0.1％的TritonX-100，pH7.8。

进一步，本发明所述阳性对照为含有长205bp的鸡属特异性的Cytb基因序列的片段，所述片段的核苷酸序列如下(SEQIDNO.1)：

TCTCCCATGGGGCCAAATATCATTCTGAGGGGCCACCGTTATCACAAACCTATTCTCAGCAATTCCCTACATTGGACACACCCTAGTAGAGTGAGCCTGAGGGGGATTTTCAGTCGACAACCCAACCCTTACCCGATTCTTCGCCTTACACTTCCTCCTCCCCTTTGCAATCGCAGGTATTACTATCATCCACCTCACCTTCCTA。

进一步，本发明所述阳性对照按如下步骤制备：