[发明专利]高产孢子的木霉菌T23-Ovel1菌株及其构建方法

说明书

本发明公开了一种高产孢子的木霉菌T23‑Ovell菌株及其构建方法，其构建包括vell基因过表达框的构建和ATMT转化；利用重叠PCR在深绿木霉菌T23的vell基因编码框前融合色氨酸强启动子，在vell基因编码框后融合色氨酸终止子，获得vell基因过表达框；通过ATMT将vell基因过表达框插入深绿木霉T23基因组DNA中，获得转化子；对转化子进行验证、筛选，即可。本发明主要从分子遗传水平上通过过表达调控孢子形成的转录因子，获得高产孢子的木霉菌的改良菌株，本方法构建过表达菌株产孢子量明显高于野生株。并且该菌株经过继代培养，其高产分生孢子性状能够稳定遗传，为开发高效木霉菌生防菌剂提供优良的菌株资源。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种高产孢子的木霉菌T23-Ovel1菌株及其构建方法。

背景技术

木霉生防制剂是以木霉菌分生孢子、菌丝体或厚垣孢子等为主要成分，用于防治某些植物病原菌促进植物生长具有重要的生物防治价值的木霉菌剂。目前生产上常用的木霉菌剂多为分生孢子制剂，将木霉发酵制成的孢子制剂进行种子包衣或土壤处理，可以有效地防治苗期病害。早在1981年西欧国家已进行木霉菌制剂商品化生产，而我国江浙地区也早使用木霉菌制剂防治茉莉花白绢病。目前木霉生防制剂占全世界生防制剂市场的60％，截止2012年国内外已经登记的木霉菌制剂所用菌株主要包括棘孢木霉(T.asperellum)、深绿木霉(T.atroviride)、哈茨木霉(T.harzianum)和绿色木霉(T.viride)4个种的菌株共50多种，其中的多数木霉菌制剂用于植物土传病害的防治，如立枯丝核菌、镰刀菌、疫霉、腐霉等。其中，后期商品化程度较高的木霉菌制剂主要有美国的Topshield(T.harzianum T-22)、以色列的Trichodex(T.harzianum T39)及MakhteshimAgan公司的Trichodex木霉菌制剂等。

木霉菌能在其生长周期内三种不同的繁殖体——菌丝体、分生孢子和厚垣孢子，将木霉生防制剂按成分分为菌丝体制剂、分生孢子制剂和厚垣孢子制剂。菌丝体制剂可在土壤中迅速生长，制剂储存和活化过程不必保持无菌条件，但使用不方便，储存期短；分生孢子制剂是目前商品化程度最高的木霉制剂，主要优点是产量高、易培养，但其货架期较短；而厚垣孢子制剂，由于厚垣孢子具有耐干燥、耐低温、对土壤抑菌作用不敏感，存活期长，易加工储藏。因此木霉菌剂的孢子活性和数量一直是木霉菌剂商业化发展的瓶颈和障碍。

为了获得高产孢子的木霉菌剂，目前已有的研究多是发酵工艺的改进，从培养基成分和培养条件两方面共同提高孢子产量和活力，庄敬华等(2005)研究表明通过控制木霉菌在液体发酵中的温度和pH值，有利于产生分生孢子。而张广志等(2013年)发现：秸秆的细度对木霉产分生孢子有影响，粗基质有利木霉产孢，基质的细度在10-40目时木霉孢子产量最大；适量含水量对木霉产分生孢子有显著影响，发酵培养基含水量调整在60％-70％对木霉产分生孢子最为适宜；接种后静止培养有利于木霉产分生孢子。而培养工艺上的改进缺少普遍适应性，加大实际生产中的难度，且实验培养基取材地的差异影响试验结果的稳定性。随着木霉菌分子生物学研究的深入，尤其是发现木霉菌中存在vel1编码的Velvet蛋白，其作为转录因子显著的调控其生长和发育，影响孢子的形成，这一发现为从遗传水平上改进木霉菌发酵产生孢子的数量和活力提供了可控制的方向。并且利用改良的ATMT遗传转化技术，在木霉菌中过表达vel1基因，实现vel1基因调控的孢子的形成数量和活力明显增加。需要指出的是，基因的过表达是常规的概念，但不同的过表达构建方式不同，且基因过表达后也不一定都能高产孢子，要经过筛选和鉴定。

发明内容