[发明专利]一种采用多重内引物进行恒温扩增核酸的方法及应用

权利要求书

1.一种恒温扩增核酸的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)自所述目的基因片段的3’端起，设定第一任意序列F3c，第二任意序列F2c-1，第三任意序列F1c-1，第四任意序列F2c-2，第五任意序列F1c-2，自所述目的基因片段的5’端起，设定第六任意序列B3，第七任意序列B2-1，第八任意序列B1-1，第九任意序列B2-2，第十任意序列B1-2；

(2)提供引物FIP1，所述引物FIP1含有与序列F2c-1互补的序列F2-1，在所述序列F2-1的5’端连接有序列F1c-1，提供引物FIP2，所述引物FIP2含有与序列F2c-2互补的序列F2-2，在所述序列F2-2的5’端连接有序列F1c-2，提供引物BIP1,所述引物BIP1含有序列B2-1，在所述序列B2-1的5’端连接有与序列B1-1互补的序列B1c-1，提供引物BIP2，所述引物BIP2含有序列B2-2，在所述序列B2-2的5’端连接有与序列B1-2互补的序列B1c-2，提供引物F3，所述引物F3含有与序列F3c互补的序列F3，提供引物B3，所述引物B3含有序列B3；在序列F2c-1和F1c-1之间选取区段设计与所述区段反向互补的引物LF1，在序列F2c-2和F1c-2之间选取区段设计与所述区段反向互补的引物LF2，在序列B2c-1和B1c-1之间选取区段设计与所述区段反向互补的引物LB1，在序列B2c-2和B1c-2之间选取区段设计与所述区段反向互补的引物LB2；

(3)在链移位型聚合酶、解链温度调节剂、引物、和缓冲液存在下，使用目的基因片段作为模板在63～65℃中扩增DNA；

(4)检测步骤(3)的扩增结果。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述的检测为可视颜色变化法检测、电泳检测或实时荧光检测。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述链移位型聚合酶为Bst DNA聚合酶、所述解链温度调节剂为甜菜碱。

4.权利要求1所述的方法在检测单增李斯特菌中的非诊断目的的应用，其特征在于，所述引物FIP1的序列如SEQ ID NO:1所示，所述引物FIP2的序列如SEQ ID NO:2所示，所述引物BIP2的序列如SEQ ID NO:3所示，所述引物BIP1的序列如SEQ ID NO:4所示，所述引物F3的序列如SEQ ID NO:5所示，所述引物B3的序列如SEQ ID NO:6所示，所述引物LF1的序列如SEQ ID NO:7所示，所述引物LF2的序列如SEQ ID NO:8所示，所述引物LB2的序列如SEQ IDNO:9所示，所述引物LB1的序列如SEQ ID NO:10所示。

5.一种检测单增李斯特菌的试剂盒，所述试剂盒包括：

(1)自所述目的基因片段的3’端起，设定第一任意序列F3c，第二任意序列F2c-1，第三任意序列F1c-1，第四任意序列F2c-2，第五任意序列F1c-2，自所述目的基因片段的5’端起，设定第六任意序列B3，第七任意序列B2-1，第八任意序列B1-1，第九任意序列B2-2，第十任意序列B1-2时，提供引物FIP1，所述引物FIP1含有与序列F2c-1互补的序列F2-1，在所述序列F2-1的5’端连接有序列F1c-1，提供引物FIP2，所述引物FIP2含有与序列F2c-2互补的序列F2-2，在所述序列F2-2的5’端连接有序列F1c-2，提供引物BIP1,所述引物BIP1含有序列B2-1，在所述序列B2-1的5’端连接有与序列B1-1互补的序列B1c-1，提供引物BIP2,所述引物BIP2含有序列B2-2，在所述序列B2-2的5’端连接有与序列B1-2互补的序列B1c-2，提供引物F3，所述引物F3含有与序列F3c互补的序列F3，提供引物B3，所述引物B3含有序列B3，在序列F2c-1和F1c-1之间选取区段设计与所述区段反向互补的引物LF1，在序列F2c-2和F1c-2之间选取区段设计与所述区段反向互补的引物LF2，在序列B2c-1和B1c-1之间选取区段设计与所述区段反向互补的引物LB1，在序列B2c-2和B1c-2之间选取区段设计与所述区段反向互补的引物LB2；

(2)链移位型聚合酶、解链温度调节剂、恒温扩增缓冲液。