[发明专利]一种基于纳米金生长的可视化免疫分析方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于纳米金生长的可视化免疫分析方法，属于分析化学和纳米科技领域。

背景技术

比色传感器由于它的简单和实用性已经广泛应用于科研和工业领域。该传感器可以用紫外仪器检测，甚至可以肉眼检查，因此非常适用，例如应用在即时测试和环境食品检测方面。一个理想的比色传感器应该至少满足以下几个方面：高灵敏性，适用的分析物范围广，裸眼检测。本发明中我们展示了一种比色传感器，基于传统酶联免疫反应和酶诱导的金棒生长相结合，几乎可以满足以上提到的所有条件。

酶联免疫反应是一种广泛应用的免疫分析方法，它利用了酶的生物特性和抗体抗原的特异性结合。由于酶较高的生物特性和抗体抗原的特异性识别，保证了该免疫方法具有较高的灵敏性和特异性，因此酶联免疫反应能够用于检测较宽范围的目标物。该方法已经广泛的应用于很多方面，例如，临床诊断，环境监测，食品质量监控，科研研究等。传统的酶联免疫反应，信号的产生是由于酶底物转变为有色物质，并且随着目标物浓度的升高，溶剂的颜色逐渐加深。单一颜色的强度变化人眼不易观察，因此裸眼只能定性检测，需要借助酶标仪来定量检测，限制了即时检测的实用性。

目前，关于可视化检测抗体-抗原反应的方法已有很多相关报道，例如蒋兴宇等2014年公开了一种新型抗体-抗原检测方法的专利CN104089950A，该方法结合了酶联免疫反应和点击化学反应，利用贵金属特殊的光学性质，实现对目标物的可视化检测。该发明的重点在于，利用酶催化底物产生抗坏血酸，它能将二价铜离子还原为一价铜离子，通过表面功能化的金纳米粒子和一价铜催化的点击化学反应来可视化地分析碱性磷酸酶的含量；结合酶标记抗体技术，将碱性磷酸酶标记的抗体用于抗原-抗体相互作用的免疫分析中，利用上述可视化分析碱性磷酸酶的方法可达到可视化分析抗原-抗体相互作用的目的，通过肉眼观察金纳米粒子的溶液颜色从红色变成蓝色或紫色，从而实现对待检测样品中抗原抗体反应的可视化检测。

本发明中，我们展示了一种酶诱导纳米金棒生长的等离子体共振酶联免疫分析方法。贵金属纳米粒子由于其独特的光学性质应用于研究的各个方面，金棒作为一种颜色变化较为丰富的种类，更是备受喜爱。该方法的发明基于商业化的碱性磷酸酶酶联免疫反应体系，碱性磷酸酶是一种水解酶，它能够从许多分子上脱去磷酸基团。该发明体系中，碱性磷酸酶用于去除抗坏血酸过磷酸酯上的磷酸基团产生还原剂抗坏血酸。一定量的金核和金棒生长液存在下，反应产生的不同量的抗坏血酸用于还原氯金酸，能够形成不同尺寸和纵横比的纳米金棒，因此，当体系中存在不同浓度目标物时，金棒的形态不同，对应的颜色也不同，从而实现对目标物的可视化定量检测。

发明内容

本发明针对现有仪器操作复杂、价格昂贵，传统可视化酶联免疫吸附法显色单一、定量效果差等问题，提出了一种快速、灵敏、多色彩的可视化检测分析方法。

为了实现上述目的，本发明所述的一种可视化酶联免疫分析方法，利用碱性磷酸酶（ALP）与抗坏血过磷酸酯（AA-P）反应生成还原剂抗坏血酸（AA），在金棒生长液和金核同时存在下，利用生成的不同量的AA还原氯金酸生成单质金沉积在金核表面，从而得到不同大小的金棒，表现出溶液颜色和紫外吸收光谱图特征随目标物浓度变化，用于目标物的可视化定量测定。

一种可视化酶联免疫分析方法包括以下步骤：

（1）向已包被有目标捕获抗体的酶标板中加入不同浓度的能与之特异性结合的抗原100μL，反应1h；

（2）向步骤（1）中加入ALP标记的100μL试剂盒自身配带的已经标记有碱性磷酸酶的检测抗体，反应1-2h；

（3）向步骤（2）中加入50μL抗坏血酸过磷酸酯（购自于sigma公司）与ALP反应1h；

（4）移取步骤（3）所得到的反应液20μL至220μL金棒生长液中，随后加入10μL预先采用NaBH₄还原法合成好的纳米金核溶液，混匀反应1h后，使用酶标仪测吸收光谱，并使用数码相机记录下溶液的颜色；

（5）处理步骤（4）所得到的数据，并绘制工作曲线。

（6）按照上述实验步骤，检测模拟待测样品。

所述的金棒生长液为包含有终浓度为0.1MCTAB、0.06mMAgNO₃、0.5mMHAuCl₄的混合液。