[发明专利]一种鉴定三带喙库蚊的实时荧光PCR引物和探针及其应用

说明书

技术领域

本发明属于昆虫鉴定技术领域。更具体地，涉及一种用于海滨库蚊亚组中三带喙库蚊鉴定的实时荧光PCR引物和探针及其应用。

背景技术

三带喙库蚊（Culextritaeniorhynchus）属双翅目蚊科库蚊属库蚊亚属海滨库蚊组海滨库蚊亚组，兼吸人和动物血，是流行性乙型脑炎的主要传播媒介。主要分布：国内除新疆、西藏未见记录，分布于全国各地；国外分布于巴基斯坦、印度、孟加拉国、斯里兰卡、缅甸、泰国、柬埔寨、越南、马来西亚、新加坡、印度尼西亚、菲律宾、日本、朝鲜、原苏联、中东、东非等。

海滨库蚊亚组蚊种包括：海滨库蚊、三带喙库蚊、白霜库蚊、环带库蚊、伪杂鳞库蚊等，主要鉴定特征是翅无显著的黑白斑，但雄蚊尾器结构复杂，同一亚组形态特征极为接近，鉴定难度大。三带喙库蚊是该亚组中具有重要医学意义的蚊种，主要鉴别特征：头顶竖鳞暗而平齐；盾鳞暗棕呈花椒色；雄蚊触须第3节腹面有一行垂毛；雌蚊食窦甲齿纤维状；后股末端黑环很窄；幼虫7-Ⅰ分2芒枝；栉齿末端圆而有繸。但受限于鉴定人员的经验积累，仅凭形态学鉴定将三带喙库蚊与同一亚属蚊种进行鉴别需要有丰富经验；同时在捕获不同发育阶段蚊种时，需培养至成虫进行鉴定，耗时较长；因采集工具等原因破坏标本的完整性，给形态学鉴定带来更大困难。

传统媒介蚊种形态学鉴定方法存在着鉴定专家数量有限、鉴定周期长、鉴定效率低等问题，随着分子生物学技术发展，基于DNA序列的物种分子鉴定技术应运而生，该技术不受蚊虫发育阶段和性别限制，且只需一部分组织提取到足够量的核酸也可进行分类鉴定，成为传统形态学鉴定的重要补充。蚊类分子鉴定技术主要包括以下几种方法：1、限制性片段长度多态性（restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP），结果稳定可靠，重复性好，但灵敏度不高，不易自动化；2、随机扩增多态性DNA技术（RandomAmplifiedPolymorphicDNA，RAPD），技术简单，检测速度快，但实验的稳定性和重复性差；3、基于PCR技术扩增基因组DNA限制性片段（amplifiedfragmentlengthpolymorphism），兼具RAPD与RFLP的优点，有较高稳定性，但对基因组制备纯度要求较高；4、DNA芯片技术，用于多种分子标记检测，但设备和检测成本较高；5、DNA测序技术，结果直观可靠，可对传统分类有疑问的类群或形态分类不能解决的问题进行分析探讨，也可对传统分类系统进行验证，但也存在成本较高，耗时较长问题；6、PCR和荧光PCR技术，通过扩增特异性片段进行物种鉴定，操作简便，成本较低，但找到适用的物种特异性DNA片段是难点。

LydiaA.Hill等建立快速鉴定白纹伊蚊、埃及伊蚊和盾蚊伊蚊实时荧光PCR方法，适用于蚊发育各个阶段的鉴定。与普通PCR相比，荧光PCR具有灵敏度高、特异性强、操作简便、检测时间短等优点。同时荧光PCR的扩增和产物分析都在一封闭的管中进行，较之传统的PCR方法大大减少了污染的几率，也具有较好的生物安全性。对于三带喙库蚊的荧光PCR鉴定方法还未有报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服形态学鉴定海滨库蚊亚组蚊种鉴定难题，提供一种一种快速、准确、特异性高、敏感性强的鉴定海滨库蚊亚组中三带喙库蚊的实时荧光PCR方法和试剂盒。

本发明的目的是提供上述实时荧光PCR的引物、MGB探针和检测方法。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：本发明所述的一种用于海滨库蚊亚组中三带喙库蚊鉴定的荧光PCR引物和探针，其特征在于，所述引物包括上游引物Culex-F和下游引物Culex-R，上游引物Culex-F由SEQIDNO.1所示的序列，下游引物Culex-R由SEQIDNO.2所示的序列；所述探针为Tritaeniorhynchus-P探针，探针Tritaeniorhynchus-P由SEQIDNO.3所示的序列。荧光PCR上游引物Culex-F为SEQIDNO.1所述的序列：5’-TTCAAGTAGTTTAGTAGAAAATGGAGC-3’；荧光PCR下游引物Culex-R为SEQIDNO.2所述的序列：5’-TGTAAAGAAAAAATAGCTAAATCAACTG-3’；荧光PCR探针Tritaeniorhynchus-P为SEQIDNO.3所述的序列：FAM-5'-ACAGTTTATCCACCTCT-3'-MGB。

所述探针Tritaeniorhynchus-P的5’端标记有FAM，3’端标记有非荧光淬灭基团NFQ和MGB。