[发明专利]一种偶联抗体的合成、检测方法和应用

权利要求书

1.一种偶联抗体的合成方法，其特征在于：包括以下步骤：

①Hα1-210蛋白表达、纯化、鉴定：采用RT-PCR的方法从表达人AchR的细胞系TE671中扩增AchRα1亚单位胞外段基因Hα1-210，同原核表达载体pET16b连接，构建重组表达载体，转化BL21感受态菌，IPTG诱导表达；

②DEC-205单克隆抗体纯化：MiniPerm系统中连续旋转培养分泌DEC-205，GL-117单克隆抗体的大鼠杂交瘤细胞，培养上清超滤浓缩后经50％饱和硫酸胺沉淀，最后经蛋白A/G亲和层析柱纯化；

③Hα1-210-DEC205偶联抗体合成：纯化后的抗体经2-巯基乙胺·盐酸还原后，同异型双功能交联剂SMCC活化的Hα1-210蛋白混合，4℃过夜连接。

2.Hα1-210-DEC205偶联抗体的体外细胞系实验方法，其特征在于：包括以下步骤：

①抗体标记及iDC培养：生物素标记表达纯化的Hα1-210-DEC205、Hα1-210-GL117偶联抗体以及Hα1-210，无菌取C57BL/6小鼠(B6鼠)骨髓细胞，体外诱导培养iDC；

②亲和力检测：将生物素标记的偶联抗体同iDC共孵育后以PE-Avidin染色、流式细胞仪(FlowCytometry，FCM)分析Hα1-210-DEC205与iDC的亲和力；

③体外T细胞增殖实验：通过皮下注射Hα1-210与完全弗氏佐剂(completefreund′sadjuvant，CFA)的方案免疫B6鼠构建EAMG模型；无菌取EAMG鼠脾脏和淋巴结，制备单细胞悬液，抗小鼠CD4抗体免疫磁珠分离T细胞，作为反应细胞；分别加入不同偶联抗体与丝裂霉素C预处理的iDC共孵育体系，BrdU掺入法分析T细胞的增殖；

④凋亡检测：FITC-AnnexinV/PI染色分析T细胞的凋亡；

⑤细胞因子的检测：ELISA检测培养上清中IFN-γ、TGF-α、IL-2、IL-4、IL-10等相关细胞因子的表达。

3.Hα1-210-DEC205偶联抗体在体分析方法，其特征在于：包括以下步骤：

①体内靶向iDC：将生物素标记的不同偶联抗体皮下注射EAMG动物模型，注射后24h，无菌取小鼠腹股沟淋巴结，制作冰冻切片，Avidin-PE(red)染色，同时结合FITC标记抗CD11c、抗B220、以及抗CD3的抗体染色(green)，激光扫描共聚焦显微镜观察Hα1-210-DEC205偶联抗体对iDC的靶向性；

②EAMG病情影响：偶联抗体同上治疗4周后评估EAMG症状的变化；ELISA法检测血清抗AchR抗体水平；

③免疫耐受检测：取引流淋巴结体外培养，抗CD11C抗体免疫磁珠分离DC并鉴定其表型；抗CD4抗体分离T细胞并分别给予相关刺激后观察AchR特异性T细胞免疫耐受；培养细胞以CD4、CD25抗体标记后，FCM分析Treg细胞的含量；

④长期治疗作用观察：偶联抗体同上作用后继续饲养EAMG小鼠2月，观察其长期治疗作用、测定AchR抗体水平、观察神经肌接头超微结构变化。

4.Hα1-210-DEC205偶联抗体在自身免疫性疾病的治疗上的应用。

5.根据权利要求4所述的Hα1-210-DEC205偶联抗体在自身免疫性疾病的治疗上的应用，其特征在于：Hα1-210-DEC205偶联抗体在MG疾病的治疗上的应用，Hα1-210-DEC205偶联抗体可体内靶向iDC，诱导AchR特异性T细胞耐受。