[发明专利]成纤维细胞生长因子的热稳定变体

说明书

本技术涉及经改造的人成纤维细胞生长因子‑2（FGF2）蛋白质及其使用方法。特别地，该方法和组合物涉及与野生型蛋白质相比较具有增加的热稳定性的FGF2突变体，和在胚胎干细胞的培养中使用该蛋白质的方法。

本申请是申请日为2012年3月1日，申请号为201280021174.5的、发明名称和本发明相同的发明专利申请的分案申请。

相关申请

本申请要求于2011年3月1日提交的美国临时申请61/448,107的利益，所述美国临时申请的完整内容通过引用并入本文。

发明领域

本申请的技术涉及具有增加的热稳定性的经改造的成纤维细胞生长因子-2（FGF2），及其用于培养胚胎干细胞的用途。

发明背景

人胚胎干细胞一般在含有碱性成纤维细胞生长因子蛋白质的培养基中培养。生长因子通常以成纤维细胞饲养层的形式或通过使用成纤维细胞条件培养基供应。用重组生长因子和细胞因子补充此类培养基帮助加强胚胎的和诱导的多能干细胞二者的自我更新和分化。

在这点上，成纤维细胞生长因子-2（FGF2）是人胚胎干细胞培养基的重要组分，因为它帮助维持细胞处于未分化状态。因此，FGF2的一个功能是延长细胞的多能性时期并且因此延长其分化成多种不同细胞类型的能力。参见Xu C等人（2005）Stem Cells23:315-323。足够高浓度的FGF2允许在不含成纤维细胞的成纤维细胞非条件培养基中培养人胚胎干细胞。参见Levenstein ME等人（2006）Stem Cells24:568-574。

然而，当与胚胎干细胞在37℃温育延长的时期时，FGF2在成纤维细胞非条件培养基中比在成纤维细胞条件培养基中更快速降解。参见Levenstein ME等人（2006）Stem Cells24:568-574。因此，通常需要每天用新鲜FGF2补充非条件培养基，以便维持培养物中的有效浓度。从成本角度来看，FGF2在培养物中的短半衰期在工业中尤其是在采用大规模细胞培养以产生基于干细胞的治疗学的制造方案的背景中构成关注。

发明概述

一般而言，本公开内容提供用于培养胚胎干（“ES”）细胞的组合物和方法。具体地，公开内容提供与野生型FGF2相比较，具有增加的热稳定性的FGF2变体。

在一些实施方案中，组合物包含编码选自下述的多肽的分离多核苷酸：（i）SEQ IDNO:2的变体或其片段，其包含选自Q65L、Q65I、Q65V、N111A、N111G、C96S和C96T的至少一个氨基酸置换；和（ii）与SEQ ID NO:2具有至少85%序列同一性的多肽或其片段，其包含选自Q65L、Q65I、Q65V、N111A、N111G、C96S和C96T的至少一个氨基酸置换。

在一些实施方案中，编码的多肽包含氨基酸置换Q65I、N111G和C96S。在一些实施方案中，权利要求1的分离多核苷酸，其中编码的多肽包含SEQ ID NO:8。

在另一个方面，公开内容提供包含编码选自下述的多肽的分离多核苷酸的表达载体：（i）SEQ ID NO:2的变体或其片段，其包含选自Q65L、Q65I、Q65V、N111A、N111G、C96S和C96T的至少一个氨基酸置换；和（ii）与SEQ ID NO:2具有至少85%序列同一性的多肽或其片段，其包含选自Q65L、Q65I、Q65V、N111A、N111G、C96S和C96T的至少一个氨基酸置换。在一些实施方案中，编码的多肽包含氨基酸置换Q65I、N111G和C96S。在一些实施方案中，表达载体包含编码SEQ ID NO:8的多肽的多核苷酸。