[发明专利]一种信号肽及其在利用淀粉产L-谷氨酸重组菌中的应用

说明书

一种信号肽及其在利用淀粉产L‑谷氨酸重组菌中的应用，属于基因工程和酶工程领域。本发明通过分子克隆技术和基因工程技术将去除N端信号肽的α‑淀粉酶的融合前期筛选出一条高效分泌α‑淀粉酶的信号肽SEQ ID N0.1，构建表达载体，在高产L‑谷氨酸的菌种中表达。首次报道，以该信号肽介导分泌α‑淀粉酶的重组天津短杆菌SW07‑1/pMSPamy能利用廉价淀粉发酵生产L‑谷氨酸，最优碳源添加条件下5L发酵罐上产量为67g/L。

技术领域

利用一种信号肽使重组菌高效分泌特定酶代谢廉价碳源进行氨基酸生产的方法和高效生产某种蛋白的方法，属于基因工程、蛋白质与酶工程和代谢工程领域。

背景技术

淀粉，作为微生物工业碳源的主要来源，一般需要经过液化和糖化两个阶段才能为微生物所利用。能直接利用淀粉作为碳源的微生物主要有链霉菌属、解淀粉芽孢杆菌及各种霉菌，而大部分用于生产的菌种无法直接利用淀粉作为碳源。现国内外已有报道，改造酿酒酵母直接以淀粉为碳源生产乙醇，导入α-淀粉酶基因使谷氨酸棒状杆菌利用可溶性生产L-赖氨酸的相关报道。

基于本本研究室以授权的专利(公开号：CN103243128A)所述并保藏的高产L-谷氨酸的菌种天津短杆菌SW07-1，只能以葡萄糖为主要碳源发酵生产L-谷氨酸，不能直接利用淀粉作为主要碳源。

发明人获得的高产L-谷氨酸的菌种只能以葡萄糖为主要碳源发酵生产L-谷氨酸，不能直接利用淀粉作为主要碳源。

L-谷氨酸主要用于生产味精、香料，以及用作代盐剂、营养增补剂和生化试剂等。通过基因工程和代谢工程技术进一步改造高产L-谷氨酸菌种，使其能利用淀粉作为碳源发酵生产L-谷氨酸。对简化L-谷氨酸生产工艺、节约生产成本有一定的参考应用价值。

发明内容

本发明通过基因工程技术将去除自身信号肽的α-淀粉酶基因与来源谷氨酸棒状杆菌和枯草芽孢杆菌的Sec和Tat两个主要分泌途径的十二条信号肽分别融合，并比对α-淀粉酶在L-谷氨酸高产菌种中的分泌效果，得到经密码子优化的β-甘露聚糖基因的信号肽——Mannase Signal Peptide(MSP)为分泌胞外酶效果较好的一种新发现信号肽。

所述MSP核苷酸序列是SEQ ID N0.1所示的序列。

本发明在已有高产L-谷氨酸菌种的基础上，通过基因工程技术将β-甘露聚糖基因的信号肽融合到去掉自身信号肽的α-淀粉酶基因，构建表达载体导入到L-谷氨酸高产菌中，并成功表达。使其能以可溶性淀粉和葡萄糖作为混合碳源进行L-谷氨酸发酵。

本发明构建的重组天津短杆菌SW07-1/pMSPamy优化后5L发酵48h L-谷氨酸的产量为67±1.3g/L，发酵液中α-淀粉酶的酶活为2103±7.6U/mL。(碳源为50g可溶性淀粉和70g葡萄糖)。

所述的技术方案：

1.根据NCBI上公布的相关基因序列设计信号肽和目的基因融合引物。

2.重组菌的构建

从相关菌种中抽提染色体DNA为模板，根据预先设计好的引物、PCR扩增条件和扩增体系进行PCR。采用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，琼脂糖核酸凝胶电泳检验回收产物的浓度。用相同的限制性内切酶对相关表达载体和纯化后的PCR产物进行双酶切，琼脂糖核酸凝胶电泳检测酶切产物并用凝胶回收试剂盒对其回收，并用超微量分光光度计检测其浓度。将酶切后的载体和PCR产物按一定比例混合，在T4DNA连接酶的作用下过夜连接。将连接产物用CaCl₂转化法转入E.coli BL21，获得含重组质粒的E.coli BL21。提取质粒，通过单双酶切及PCR验证后用电转化方法将重组质粒导入相关菌种中。最后，将含15％甘油的重组菌液保存-70℃冰箱。

3.重组菌的产酸培养