[发明专利]一种基于相干反斯托克斯拉曼散射效应的超分辨显微成像方法

说明书

一种基于相干反斯托克斯拉曼散射效应的超分辨显微成像方法，它涉及一种成像方法。本发明的目的是为了解决现有技术的光学显微成像方法成像时间长，成像光路复杂，对成像结构要求高的问题。本发明将泵浦光、斯托克斯光和探测光共线聚焦于样品，调整泵浦光、斯托克斯光和探测光的聚焦光斑中心的距离使三束光斑边缘相互重叠，形成三束光聚焦光斑的共同重叠区域；向外侧移动泵浦光、斯托克斯光和探测光聚焦光斑中心，减小共同重叠区域的面积。本发明光路结构相对简单，易于实现。

技术领域

本发明涉及一种成像方法，具体涉及一种基于相干反斯托克斯拉曼散射效应的超分辨显微成像方法，属于光学显微成像技术领域。

背景技术

长期以来，光学显微成像技术的分辨力受到衍射极限的限制。至今，利用非标记的方法获得突破衍射极限分辨率的方法有两种，一种是利用场增强效应的相干反斯托克斯拉曼散射显微镜，但它要用到尖端场增强，只能对样品表面成像，应用受到很大的限制。另一种方法是受激拉曼显微成像，它使用两束斯托克斯光，一束呈高斯型，另一束呈环形，类似荧光标记的STED方法。但这种方法只能获得分子某一化学键的拉曼谱，单靠此谱来判别样品中的分子种类是困难的，要获得分子的其它拉曼谱，就要求激光器具有宽的调谐范围，更严重的问题是需要很长的测试时间才能获得分子的完整拉曼谱，为获得样品的三维超衍射分辨图像，所需成像时间太长。

相干反斯托克斯拉曼散射(CARS：Coherent Anti-Stokes Raman Scattering)是利用四波混频的三阶非线性效应而产生反斯托克斯光信号的效应，现有技术中通过增加一与泵浦光和斯托克斯光同时共线聚焦于样品的附加探测光，该附加探测光耗尽泵浦光和斯托克斯光在其焦斑周边产生的声子，形成无用的CARS信号，而延迟的探测光中符合相位匹配条件的光子则与焦斑中心区域的声子碰撞形成有用的CARS信号，将无用的CARS信号分离，即可获得超衍射极限的空间分辨率。因采用具有宽带的超连续谱激光作为泵浦光和斯托克斯光，从而获得分子的完整CARS谱信号，实现对整个分子成像。然而，该方法所需的激光波长为4种，光路复杂且对调节机构要求很高，实现起来极为困难；公开号为CN102608100A的专利文献公开了一种“利用光纤产生的四波频信号进行CARS成像的系统及方法”，其将四波混频信号作为CARS成像的探针光，与一束泵浦光和一束斯托克斯光构成三束光聚焦在样品上进行三色CARS成像，解决现有技术的光学显微成像方法成像时间长，成像光路复杂，对成像结构要求高的问题。根据该专利文献，发明人想到，若能够在此技术基础上进一步提高成像分辨率，则会获得突破衍射极限的成像分辨率。

发明内容

本发明的目的是为了解决如何提高泵浦光、斯托克斯光和探测光进行CARS成像的成像分辨率的问题，提供了一种基于相干反斯托克斯拉曼散射效应的超分辨显微成像方法。

本发明的技术方案是：一种基于相干反斯托克斯拉曼散射效应的超分辨显微成像方法，包括以下步骤：

步骤一、将泵浦光、斯托克斯光和探测光共线聚焦于样品，调整泵浦光、斯托克斯光和探测光的聚焦光斑中心的距离使三束光斑边缘相互重叠，形成三束光聚焦光斑的共同重叠区域；

步骤二、在步骤一的基础上沿三个不同方向向外侧移动泵浦光、斯托克斯光和探测光聚焦光斑中心，减小所述共同重叠区域的面积；

步骤三、获取由共同重叠区域所产生的反斯托克斯光信号进行成像。

所述泵浦光、斯托克斯光和探测光均为超短激光脉冲。

所述泵浦光、斯托克斯光和探测光的聚焦光斑中心连线的距离近似相等。

所述泵浦光、斯托克斯光和探测光为空心光束。