[发明专利]一种制备食品级海藻糖的黑曲霉工程菌的构建方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种制备食品级海藻糖的黑曲霉工程菌的构建方法与应用，特别涉及一种同源重组黑曲霉菌株生产麦芽寡糖基海藻糖合成酶-麦芽寡糖基海藻糖水解酶融合酶制造海藻糖的方法，属于基因工程和酶工程技术领域。

背景技术

海藻糖是一种非还原性二糖，分子式是C₁₂H₂₂O₁₁·2H₂O，广泛分布于自然界中许多生物细胞中，既是一种贮藏性糖类，又是应激代谢的重要产物。海藻糖不仅可以作为碳源和能源，而且还具有保存生物活力的特殊功能，它具有保护生物细胞和生物活性物质在脱水、干旱、高温、冷冻、高渗透压及有毒试剂等不良环境条件下活性免遭破坏的功能。由于海藻糖具有广泛而独特的生物学功能，广泛受到各个国家的密切关注，以致引发了世界性的海藻糖研究和开发热潮。

黑曲霉是一种广泛存在于自然界的腐生真菌，又是重要的工业发酵微生物，在工业酶制剂、有机酸发酵方面应用广泛。可生产淀粉酶、酸性蛋白酶、纤维素酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶等超过30种酶制剂。因为黑曲霉出色的蛋白质分泌能力，黑曲霉也被开发为通用的异源蛋白表达载体。黑曲霉具有强大的聚合物降解酶系，赋予其在各种廉价的培养基上快速生长和发酵的能力，能够在极低的pH下保持旺盛的代谢活性，因而不易染菌，能够适应工业发酵中粗放的物料和理化环境，这些品质使黑曲霉成为一种不可多得的工业生产宿主菌，即细胞工厂。通过各种条件的优化，黑曲霉自身糖化酶产量甚至达到了30g/L。

目前海藻糖的生产工艺主要有三种：

(1)提取法

提取法主要通过培养海藻糖含量较高天然生物来获取，目前主要的提取对象为酵母(海藻糖含量约占酵母干重的15％)，但由于海藻糖属于酵母内容物，提取时需要进行复制的破壁及分离提取工艺，因此目前逐渐被酶法制备海藻糖法取代。

(2)单酶法

单酶法在1995年由日本Nishimoto等人首次提出，即采用海藻糖合酶转化麦芽糖生产海藻糖的工艺。海藻糖合酶能够将α,α-1,4-糖苷键连接的麦芽糖直接转化为α,α-1,1-糖苷键连接的海藻糖，该转化反应不需要磷酸盐的存在，不需要消耗高能物质，但该方法所采用的酶热稳定性一般较低，且转化率多为60％左右，另外由于该酶同时具有轻微的水解活性，因此单酶法转化过程中还会产生少量副产物的葡萄糖。

(3)双酶法

双酶法在1991年由Lama等人首次报道，即采用麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)和麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)两种酶利用淀粉为底物生产海藻糖的方法。该方法中第一种酶用来催化聚合度(DP)大于3的麦芽糊精，转化其还原端的α-1,4连接键生成α-1,1连接键。第二种酶专一性催化水解α-1,4键生成的α-1,1键海藻糖和低分子量的麦芽低聚糖。目前双酶法多数以还原性淀粉为原料，转化率多为70-80％左右，因此较单酶法相比更为经济，除能够生产海藻糖之外，还可以同时产生具有较高附加值的麦芽三糖，因此该工艺路线已被用于工业化生产。

虽然双酶法具有以上诸多优点，但依然存在不足之处：双酶法转化所用两种酶需要分别进行发酵及纯化才能获取，因此酶的生产成本明显高于单酶法。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种制备食品级海藻糖的黑曲霉工程菌的构建方法与应用。

本发明技术方案如下：

一种制备食品级海藻糖的黑曲霉工程菌的构建方法，包括如下步骤：

(1)分别PCR扩增麦芽寡糖基海藻糖合成酶基因TreY与麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因TreZ，同时PCR扩增黑曲霉糖化酶基因的上游基因片段Gla5和下游基因片段Gla3、Gla3a；所述的黑曲霉糖化酶基因的上游基因片段Gla5的核苷酸序列如SEQIDNO.1；所述的黑曲霉糖化酶基因的下游基因片段Gla3的核苷酸序列如SEQIDNO.2；所述的黑曲霉糖化酶基因的下游基因片段Gla3a的核苷酸序列如SEQIDNO.3；