[发明专利]牛源性成分鉴定及其制品中多物种种源成分的检测试剂盒

说明书

本发明提供了牛源性成分鉴定及其制品中多物种种源成分的检测试剂盒，属于动物种源性成分分子检测技术领域。本发明试剂盒包括SEQ ID No.2&3所示的特异性引物、反应试剂以及阳性和空白对照。此外还包括猪、马属、兔、狐、狗、水貂、鼠、鸡、鸭的特异性引物，其核苷酸序列如SEQ ID No.4～21所示。采用本发明的引物扩增样品DNA，对PCR扩增产物进行分析，可判定样品中是否含有牛源性成分，以及是否掺有猪、马属、兔、狐、狗、水貂、鼠、鸡、鸭等其他动物成分。本发明为肉类、皮张和饲料中上述动物源性成分的检测提供了有效、精准、可靠的手段，具有简便、快速、全面、特异性强的特点，且成本较低，适用性广。

技术领域

本发明涉及动物分子生物学领域，具体涉及牛源性成分鉴定及其制品中多物种种源成分的检测试剂盒。

背景技术

在我国动物性食品的消费中，牛肉仅次于猪肉，其营养价值高，古有“牛肉补气，功同黄芪”之说。牛肉含有丰富的蛋白质，氨基酸组成比猪肉更接近人体需要，而脂肪含量低，故味道鲜美，享有“肉中骄子”的美称。牛肉富含肌氨酸、维生素、肉毒碱、丙氨酸等营养成分，铁、钙、钾、镁等微量元素含量丰富，且含有一种共轭亚油酸的脂肪酸，能够减少脂肪沉积，有减肥功效，因此牛肉产品受到越来越多消费者的青睐。

随着经济的快速发展及生活水平的提高，人们对食物的要求也由此改变，从过去追求数量上的满足，转向现在的讲求美味营养、卫生与安全。然而，肉制品行业涉及领域多，产业链长，与农业的关联度强，与国际市场联系紧密，其安全监管则成为了一大难题，故肉制品的安全性已成为消费者高度关注的社会问题。近年来，世界范围内的肉制品安全事件频频发生，欧洲的“马肉风波”中，生产者用马肉冒充高档牛肉，严重损害消费者的利益。此外，在饲料、皮张中动物源性成分掺假的现象也时有发生。因此，针对牛源性制品建立一套科学、准确、快速、低廉的检测方法是十分必要的。

日常生活中人们通常依靠感官和经验进行动物产品鉴别，但是随着加工方法的改进和各类制品中掺假成分的多元化、种类的复杂化，这种方法已远不能达到对肉制品掺假现象进行控制与监管的目的。随着现代分子生物学的发展，以聚合酶链式反应(PCR)为基础的技术已成为动物源性成分鉴定的核心方法。同时，DNA也因其高稳定性和在不同组织中的同一性被选作比蛋白质更可靠的分析靶点。目前，根据线粒体基因组DNA序列差异设计物种特异性引物所建立的PCR方法已有大量报道(Ghovvati S,Nassiri M R,Mirhoseini S Z,Heravi M A,JavadmaneshA.Fraud identification in industrial meat products bymultiplex PCRassay.Food Control,2009,20(8):696-699；Girish P S,Anjaneyulu A SR,Viswas K N,Shivakumar B M,Anand M,Patel M,Sharma B.Meat speciesidentification by polymerasechain reaction-restriction fragment lengthpolymorphism(PCR-RFLP)of mitochondrial 12S rRNA gene.Meat Science,2005,70(1):107-112；Dooley J J,Paine K E,Garrett S D,Brown H M.Detection of meat speciesusing TaqMan real-time PCR assays.Meat Science,2004,68(3):431-438.)，且进入了中国权威的检测技术标准(步迅，张全芳，刘艳艳.一种同时鉴定山羊、绵羊、猪和鸭肉源性的荧光标记基因复合扩增方法[P]，中国专利：CN103397101A,2013-11-20；张英杰，刘月琴，陈睿赜，刘彦琴，郭云霞，李雪梅，杨佳栋，锡建中.一次性鉴别羊肉、鸡肉、鸭肉、猪肉的PCR检测方法及试剂盒[P]，中国专利：CN104099405A，2014-10-15.)。但是线粒体DNA拷贝数多，在不同组织中含量不同，稳定性差且难以进行定量分析。而动物细胞核基因组DNA序列具有高度的物种特异性，能够避免非特异性扩增，更加适合用作PCR定性和定量分析。目前，国际上以细胞核DNA序列为目标序列，用于鉴别肉源的PCR检测方法大多只能区分开牛、羊、猪、鸡、鸭等常见肉制品(黄明，程欣，杨静，黄继超，周兴虎.一种快速检测血旺中鸡鸭猪血液成分的方法[P]，中国专利：CN103525908A,2014-01-22；黄明，黄玮玲，杨静，徐幸莲，周光宏.一种添加扩增内标的食品中猪肉或鸡肉成分Taqman探针荧光定量PCR快速检测方法[P]，中国专利：CN102864243B，2013-9-25)。而肉产品市场掺假的复杂性(例如，我国多地的“混合羊肉”事件，不法分子将狐狸、水貂、鼠等动物肉，添加进羊肉里销往江苏、上海等地的农贸市场；欧洲“马肉风波”以马肉冒充高档牛肉等)表明，一种更加快速、简便、准确、全面的肉类掺假的检测方法成为迫切的需求，而目前用于能同时鉴别马、狐狸、水貂、鼠等动物源性成分的PCR检测方法尚未见报道。此外，在饲料、皮张中动物源性成分掺假的现象也时有发生。因此，建立用于鉴别多物种的快速检测方法对食品安全的监管具有重要的实践意义。