[发明专利]一种金线莲炭疽病菌PCR检测引物及其检测方法

说明书

本发明公开了一种金线莲炭疽病菌PCR检测引物及其检测方法，主要采用设计了一对金线莲炭疽病菌的特异引物（CF1：5’‑CGGAGGATAACCAAACTCTG‑3’和CR1：5’‑CGAGACGTAAAGTTACTACGC‑3’），经过PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳，可在金线莲炭疽病菌纯DNA、带菌的植株中特异性地扩增出片段长度为326bp的特异扩增产物。所发明的特异分子检测引物及其用法可用于生产实践中金线莲炭疽病菌感染的植株中炭疽病菌的快速、灵敏、特异的检测，同时可用于药用植物种植中病害的早期诊断和病菌的监测和鉴定，为金线莲炭疽病菌引起的病害的防治提供可靠的理论和技术支撑。

技术领域

本发明金线莲炭疽菌PCR检测引物及其检测方法，专用于金线莲炭疽菌高灵敏度快速PCR检测，克服了传统的培养鉴定方法繁杂且准确性低的缺点，属于农作物病害检测、鉴定及防治技术的领域。

背景技术

金线莲又名花叶开唇兰，也有人将其称为金丝草和金线入骨消等，具有很高的药用价值，如清热凉血、袪风利湿、强心利尿、固肾、平肝等功效。作为近年来备受推崇的保健药材，商家对此开发出了不少相关产品，受到消费者的广泛喜爱，但野生金线莲对生长环境的要求苛刻，加上人工的过度采挖，已面临灭绝的境地，目前，人工栽培是解决上述问题的最佳方法。在福建地区，金线莲的栽培技术也十分成熟，但金线莲的病害问题也日益凸显。最近，在福建省多个金线莲种植大棚中出现了金线莲移栽后疑似炭疽病病样，发病面积大，传染速度快，严重影响到金线莲的产量和品质。通过对病样采集、病菌分离鉴定，柯赫法则验证，最终确定金线莲炭疽病的病原菌为胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）。胶孢炭疽菌是炭疽菌属(Colletotrichum Corda.)中有着最多种类的一个种，胶孢炭疽菌菌丝最适宜生长的温度为28℃，分生孢子产生及萌发的最适温度为28℃至32℃，相对湿度为85％。

对于金线莲炭疽病的传统鉴定方法是通过对已经分离并纯化的菌株进行培养，观察，完成形态上的鉴定工作。同时，将病原菌回接到金线莲植株中，进行致病性的验证。最后，对照已有的分类资料确定引起金线莲炭疽病的病原菌的分类和地位。该法作为最基本的病原菌鉴定方法在一直以来被广泛使用，有着很强的实用性。但是不可否认，传统方法在形态学特征鉴定上对专业人员要求高，而且受人为因素和环境的影响，对操作者的实验技能和实际经验有很高的要求，十分耗时，无法达到快速检验的要求。

聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction ，PCR）技术的出现使分子生物学水平上的检测成为可能。并且，随着技术的进步，PCR技术在植物检疫中表现出了很好的应用前景。本试验利用对真菌rDNA-ITS序列的PCR扩增，获得ITS区域的特定序列，从而完成分子水平上的植物病原真菌的鉴定工作，是病原菌检测的有效且快捷的途径。

鉴于以上原因，我们利用真菌通用引物ITS1/ITS4扩增金线莲炭疽病菌的转录间隔区并进行克隆测序，通过序列比对，设计出一对金线莲炭疽病菌特异性引物，用于早期发病植株的高灵敏度快速分子检测，建立金线莲炭疽病菌快速、简便、特异性强、灵敏度高的监测技术体系。此技术可应用于金线莲炭疽病菌引起病害显症之前的早期监测，对于确定病害防治最佳时期具有重要的作用，为防治策略的制定提供技术支持。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中金线莲炭疽病菌的传统检测方法对操作者的实验技能和实际经验有很高的要求，且十分耗时，无法达到快速检验的问题，提供金线莲炭疽病菌的特异PCR检测引物以及结果可靠、易于操作、特异性强、灵敏度高的金线莲炭疽病菌的PCR检测诊断的方法。该方法可用于带菌植株的高灵敏度快速分子检测，此技术对于金线莲炭疽病菌引起病害显症之前的早期监测，确定病害防治最佳时期具有十分重要的意义。

实现本发明的目的包括下列步骤：