[发明专利]一种用Pax7基因检测牛体尺体重的方法

说明书

技术领域

本发明属于动物学领域，特别是涉及一种用Pax7基因检测牛体尺体重的方法。

背景技术

体型大小是体现牛品种生产性能高低的重要指标，因此体型大小已成为一个重要的问题。中国地方牛种，特别是南方牛种在长期自然选育和人工选育过程中，存在体型小、载肉量少的特点。通过人工选育，在保留南方牛种的地区适应性的基础上，提高南方牛种的体型，增加载肉能力是一个重要的选育目标。

分子标记辅助选择是随着现代分子生物学技术的迅速发展而产生的新技术，它可以从分子水平上快速准确地分析个体的遗传组成，从而实现对基因型的直接选择，进行分子育种。分子生物技术的发展为分子标记辅助选择提供了理论基础和技术支持，通过检测功能基因的多态性，对不同基因型个体及生产性能进行关联分析，找出优势基因型和优势等位基因，用于动物的育种过程，能够很大程度的缩短育种时间，提高育种准确性。

单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，SNP)主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，是同一物种不同个体的染色体上遗传基因单个碱基的变化。在基因组DNA中，任何碱基均有可能发生变异，因此SNP既有可能在基因序列内，也有可能在基因以外的非编码序列上。总的来说，位于编码区内的SNP(codingSNP，cSNP)比较少，因为在外显子内，其变异率仅及周围序列的1/5。而这种改变常是导致生物性状改变的直接原因，因此这些SNPs作为遗传标记在群体遗传学中具有重要的意义。

动物的生长发育主要是肌肉的生产，也是肉用的主要目标。肌肉细胞主要来自于胚胎发育时的轴旁中胚层和侧中胚层两个部分。脊椎动物的胚胎发育期，轴旁中胚层形成以后随即裂为块状细胞团，所有的骨骼肌都来自体节的生肌节区。生成骨骼肌的肌节间质细胞为呈双极形或纺锤形的单核细胞，这类细胞仍然能够进行DNA复制和细胞分裂，将进一步分化为成肌细胞。成肌细胞的仍是单核细胞，但不进行DNA复制和有丝分裂，而是在生肌特异蛋白及其同工型的作用下，融合形成肌管。肌管是多核细胞，其中含有由肌动蛋白和肌球蛋白组成的肌原纤维。细胞核位居细胞的中央，随着肌原纤维的增多，细胞核向细胞的周边移动，这时的肌管就成为骨骼肌细胞或称肌纤维。脊椎动物的肌肉组织在个体出生以后，肌纤维的数目不再改变。肌肉的生长大多数依赖肌纤维长度增加和周径增大，而不是依赖于肌细胞数目的增多。

Pax基因是一个进化上比较保守的基因家族，该基因家族普遍存在于各种生物体中。Pax基因家族有9个单独功能的基因，Pax基因家族成员的主要功能是参与动物胚胎发生过程中细胞的分化和生长。

Pax家族中的Pax3和Pax7基因在小鼠肌肉发育过程中发挥重要作用，当Pax3和Pax7基因缺失时会导致肌肉发育的停止，Pax3和Pax7基因是肌祖细胞和卫星细胞的重要调节和标记基因，在脊椎动物的早期胚胎发育和后期肌肉生长、再生和修复过程中发挥重要作用。在动物的躯干肌肉、神经脊细胞、背侧神经管以及体节形成的过程中，Pax7可以取代Pax3基因发挥功能。

综上所述，国内外的大量研究报道都证实了基因可以用来检测动物的外形特征，鉴于此，申请人在Pax7基因作为检测牛体高、体斜长和体重等指标的候选基因方面进行了研究。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种采用PCR-SSCP技术结合DNA测序的方法来检测牛的Pax7基因的序列，通过变异位点基因型的分析比较，从而预测和确定牛的体尺大小和体重。

本发明解决上述问题的技术方案如下：一种用Pax7基因检测牛体尺体重的方法，包括牛血液基因组提取、引物设计、PCR反应、PCR-SSCP分析和统计模型建立，具体包括以下步骤：

(1)牛血液基因组提取：苯酚-氯仿提取法提取牛全基因组DNA后利用TE缓冲溶液溶解DNA，采用超微量分光光度计检测DNA浓度，最后稀释至50ng/μL，存于-20℃备用；

(2)引物设计：根据NCBI登陆的牛Pax7基因序列(登录号：AC_000159.1)，设计一对引物Pax7-9上游引物和Pax7-9下游引物，其中：

Pax7-9上游引物：5'-AGCCTCCCATCCTCAGTC-3'；

Pax7-9下游引物：5'-GGACCTCATCCCAGACAGC-3'；

(3)PCR反应：利用步骤(2)中设计的引物对牛的全基因组DNA进行PCR扩增，获得牛Pax7基因位于外显子9的309bp的片段，此区域为该基因的编码区；