[发明专利]用于膀胱癌检测的逻辑与门基因线路的构建方法

说明书

技术领域

本申请涉及一种用于膀胱癌检测的逻辑与门基因线路的构建方法及其应用。

背景技术

膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，也是全身十大常见肿瘤之一。目前的诊治手段由于缺乏膀胱癌高特异性靶点等原因，不能有效地通过单靶点区分正常细胞和膀胱癌细胞，急需研发对膀胱癌更加特异的精准治疗方法。膀胱癌系统生物学和基因组学的研究，使人们有可能对肿瘤细胞基因突变以及潜在的治疗靶点有比较全面的认识和了解。

发明内容

本发明提供一种新的用于检测膀胱癌的试剂盒。

本发明提供一种用于膀胱癌检测的逻辑与门基因线路的构建方法，包括：

a)用PCR方法扩增序列：如SEQIDNO:1所示的hUPII启动子序列，如SEQIDNO:2所示的氨酰tRNA合成酶AcKRS基因序列，SEQIDNO:3所示的hTERT启动子序列，如SEQIDNO:4所示的tRNA序列，如以SEQIDNO:5所示的pCMV6-AC-GFP质粒序列为模板PCR扩增SEQIDNO:6所示的pCMV6-AC-GFP37TAG质粒序列；

b)将所述hUPII启动子与AcKRS基因，所述hTERT启动子与tRNA分别连接到如SEQIDNO:7所示的psiCHECK-2质粒中构建重组载体；

c)将所述重组载体与所述pCMV6-AC-GFP37TAG质粒，共同转入膀胱癌细胞，构建出所述基因线路。

所述膀胱癌细胞是5637。所述步骤c)中，将含有UAG终止密码子的效应基因一起转入所述膀胱癌细胞。所述效应基因是绿色荧光蛋白GFP。

一种尿道上皮细胞特异启动子hUPII与一种能在真核细胞编码乙酰化赖氨酸的氨酰tRNA合成酶AcKRS组成的DNA序列，hUPII序列如SEQIDNO:1所示，AcKRS序列如SEQIDNO:2所示。

一种癌症细胞特异启动子hTERT与一种能在真核细胞编码乙酰化赖氨酸的tRNA组成的DNA序列，hTERT序列如SEQIDNO:3所示，tRNA序列如SEQIDNO:4所示。

当将上述基因线路转入膀胱癌细胞，并加入N-乙酰-L-赖氨酸时，绿色荧光蛋白只在膀胱癌细胞中表达，而在正常细胞中不表达。

一种膀胱癌检测试剂盒，包括序列如SEQIDNO:8所示的psiCHECK-2-hUPII/AcKRS重组载体、序列如SEQIDNO:9所示的psiCHECK-2-hTERT/tRNA重组载体、序列如SEQIDNO:6所示pCMV6-AC-GFP37TAG质粒。所述的试剂盒，还包括含有UAG终止密码子的效应基因。所述效应基因是绿色荧光蛋白GFP。

本发明的有益效果是：本发明将乙酰化赖氨酸氨酰tRNA合成酶AcKRS基因、乙酰化赖氨酸tRNA分别构建在膀胱癌特异性启动子下游，并与含有UAG终止密码子的效应基因绿色荧光蛋白GFP一起转入细胞，构建的逻辑与门乙酰化赖氨酸基因线路只在膀胱癌细胞中启动乙酰化赖氨酸氨酰tRNA合成酶、乙酰化赖氨酸tRNA转录，在外源加入N-乙酰-L-赖氨酸的条件下，表达全长的绿色荧光蛋白GFP；而在其他类型细胞中，膀胱癌特异启动子无法同时启动乙酰化赖氨酸tRNA和乙酰化赖氨酸氨酰tRNA合成酶的转录，绿色荧光蛋白GFP基因翻译时会在UAG终止密码子处终止，不能表达全长的绿色荧光蛋白GFP；从而可以通过比较细胞绿色荧光强弱或者Westernblot检测GFP表达的方法，区分膀胱癌细胞和正常细胞。

附图说明

图1是跑胶检测重组载体构建情况，其中，字符1代表BglII/XhoI双酶切后的psiCHECK-2-hUPII/AcKRS重组载体，箭头所指hUPII/AcKRS的片段；2代表BglII/XhoI双酶切后的psiCHECK-2-hTERT/tRNA重组载体，箭头所指hTERT/tRNA的片段；3代表PCR定点突变的pCMV6-AC-GFP37TAG重组载体，箭头所指pCMV6-AC-GFP37TAG的片段；