[发明专利]黄颡鱼免疫球蛋白单克隆抗体的制备方法及应用

说明书

技术领域

本发明属于鱼类免疫学技术领域，具体涉及黄颡鱼免疫球蛋白单克隆抗体的制备 方法及应用。

背景技术

黄颡鱼（Pelteobagrusfulvidraco）是我国常见的一种重要的小型经济鱼类，因 其肉质鲜嫩、少细刺，深受消费者喜爱。我国黄颡鱼大规模养殖已有10余年历史，主要集中 在两湖及长三角地区。随着其养殖规模的迅速扩大，养殖密度的不断提高，疾病问题日益凸 显，其中以细菌性疾病为主。在保护水环境和食品安全的高要求之下，免疫预防成为疾病防 治的最佳手段，疫苗是其典型代表。现阶段缺乏有效的黄颡鱼免疫效果评价体系，而利用黄 颡鱼免疫球蛋白单克隆抗体对免疫后抗体水平变化规律进行分析，可以准确的评价疫苗效 果，因此，对黄颡鱼免疫球蛋白单克隆抗体的研究在疫苗的开发应用中具有重要意义。目前 未见关于黄颡鱼免疫球蛋白单克隆抗体的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种杂交瘤细胞株，并由该杂交瘤细胞株所产生的黄颡鱼免 疫球蛋白的单克隆抗体。

本发明的另一个目的是提供一种黄颡鱼免疫球蛋白单克隆抗体的制备方法。

本发明的再一目的提供一种黄颡鱼免疫球蛋白单克隆抗体的用途及其用法。

为实现目的之一，本发明采用的技术方案是：一种黄颡鱼免疫球蛋白单克隆抗体， 所述的单克隆抗体是由名称为：杂交瘤细胞株F6-F2，保藏单位为：中国典型培养物保藏中 心，保藏单位地址为：中国武汉省武汉大学；保藏号为：CCTCCNO：C2015152，保藏日期为： 2015年9月13日的杂交瘤细胞株产生。

为实现目的之二，本发明采用的技术方案是：一种所述的黄颡鱼免疫球蛋白单克 隆抗体制备方法，包括如下步骤：将黄颡鱼血清经盐析法和亲和柱层析法纯化得到黄颡鱼 免疫球蛋白；以纯化的黄颡鱼免疫球蛋白免疫BALB/c小鼠；融合免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤 细胞；经免疫学方法检测，筛选出分泌黄颡鱼免疫球蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞F6-F2； 其所分泌的抗体即为黄颡鱼免疫球蛋白单克隆抗体。

所述的盐析法和亲和柱层析法是将黄颡鱼血清经饱和硫酸铵(SAS)分级盐析沉 淀后获得粗提液，再将粗提液透析后过ProteinA亲和层析柱进行纯化。

所述的免疫学方法是间接酶联免疫吸附法。

为实现目的之三，本发明采用的技术方案是：一种所述的黄颡鱼免疫球蛋白单克 隆抗体用于对黄颡鱼疫苗免疫效果进行检测评价，所采用的方法是：利用所述黄颡鱼免疫 球蛋白单克隆抗体建立三抗体夹心酶联免疫吸附法(TAS-ELISA)。

本发明优点在于：制备了黄颡鱼免疫球蛋白的单克隆抗体及分泌该抗体的杂交瘤 细胞株，建立了三抗体夹心酶联免疫吸附法，能够对多种疫苗免疫效果进行评价，为疫苗的 开发应用奠定基础。

附图说明

图1为实施例1所提供的黄颡鱼免疫球蛋白单克隆抗体的检测黄颡鱼鲇鱼爱德华 氏菌强毒株灭活疫苗和弱毒株活疫苗不同方式免疫的血清特异性抗体水平的结果。

具体实施方式

实施例1：

一、黄颡鱼免疫球蛋白的提取

黄颡鱼血清的采集：

健康黄颡鱼尾静脉采血，室温静置1h，4℃过夜，次日4000r/min离心15min，取上清液，-80℃保存备用。

黄颡鱼免疫球蛋白的分离、纯化：

饱和硫酸铵(SAS)盐析法：黄颡鱼血清加等体积生理盐水稀释后，缓慢加入pH7.0的饱和硫酸铵至30%饱和度，4℃静置过夜，10000r/min离心30min，取上清继续加入饱和硫酸铵至最终饱和度为50%，同上处理，收集沉淀，沉淀溶解于0.02mol/LPBS（PH7.4），再经PBS4℃透析脱盐，获得黄颡鱼免疫球蛋白粗提液，-80℃保存备用。

③ProteinA亲和层析柱纯化：取黄颡鱼免疫球蛋白粗提液1.0mL，与HiTrap ProteinAHP柱4℃结合3-4h；用0.02mol/LpH7.4PBS以1.0-1.5mL/min流速洗脱未结合 蛋白至OD₂₈₀<0.01；用0.1mol/LpH3.0柠檬酸以1.0-1.5mL/min流速洗脱洗脱结合蛋白，以 200μL/管收集洗脱峰，合并洗脱峰，用0.02mol/LpH7.4PBS4℃透析过夜，-20℃保存备 用；该纯化蛋白的重链分子量为73KD，轻链分子量为30KD。

二、黄颡鱼免疫球蛋白单克隆抗体的制备