[发明专利]一种从草鱼中提取纯化胰蛋白酶的方法

权利要求书

1.一种从草鱼中提取纯化胰蛋白酶的方法，其特征在于：将草鱼胰脏经粗提液的制备、硫酸铵分级盐析、DEAE-Sephacel阴离子交换层析和Sephacryl-200凝胶过滤层析得到胰蛋白酶纯品。

2.根据权利要求1所述的提取纯化胰蛋白酶的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

（1）粗提液的制备：取清洗干净的草鱼胰脏，加入Tris-HCl缓冲液，高速匀质机捣碎，离心，收集上清作为胰蛋白酶粗提液；

（2）硫酸铵分级沉淀：

:向粗提液加固体硫酸铵至较低饱和度，静置，离心，取上清；

:向上清液中继续添加硫酸铵至较高饱和度，静置，离心收集沉淀；

:沉淀用上述同样的Tris-HCl缓冲液溶解后进行透析，透析后的样品离心，过滤得上清液；

（3）DEAE-Sephacel阴离子交换层析：用Tris-HCl缓冲液平衡DEAE-Sephacel层析柱；将酶液上样于层析柱后，先用同样的Tris-HCl缓冲液冲洗掉未结合的蛋白，再换用含一定浓度NaCl的Tris-HCl洗脱液洗脱，紫外检测，收集酶活性部分，超滤浓缩；

（4）Sephacryl-200凝胶过滤层析：用含NaCl的Tris-HCl缓冲液平衡SepharcylS-200凝胶柱，将上述浓缩液上样于该柱，用同样的含NaCl的Tris-HCl缓冲液洗脱，紫外检测仪检测并记录洗脱酶活性峰，超滤后冷冻干燥，即得成品。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤（1）中所述的缓冲液是pH7.0~9.0的含0.01~0.1mol/LNaCl、0.001~0.005mol/LCaCl2的0.02mol/LTris-HCl缓冲液。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤（1）中高速匀质机运行频率为10~20sec/次，捣碎20~30次；离心机转速12000~15000rpm,4℃离心15~20分钟。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤步骤（2）I中，加硫酸铵至10%~30%饱和度，静置1~2h,12000~15000rpm,4℃离心15~20分钟。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤（2）II中，加硫酸铵至60%~70%饱和度；静置1~2h,12000~15000rpm,4℃离心15~20分钟。

7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤（2）III中，透析时间为15~20h,期间更换3~5次透析液，每次透析液用量为样品体积的15~20倍；透析后12000~15000rpm,4℃离心15~20分钟；上清液用3~5层纱布过滤后得层析用酶液。

8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤（3）中，平衡液是pH7.0~9.0的含0.01~0.1mol/LNaCl、0.001~0.005mol/LCaCl2的0.02mol/LTris-HCl缓冲液；洗脱液为pH7.0~9.0的含0.05~0.5mol/LNaCl0.02mol/LTris-HCl缓冲液；活性部分用YM-10超滤膜进行超滤浓缩。

9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤（4）中，平衡液是pH7.0~9.0的含0.1~0.3mol/LNaCl的0.02mol/LTris-HCl缓冲液；洗脱液经4℃透析过夜，冷冻干燥得胰蛋白酶纯品。