[发明专利]枸杞番茄红素ε-环化酶基因及包括该基因的重组载体

说明书

技术领域

本发明涉及一种枸杞番茄红素ε-环化酶基因及包括该基因的重组载体，

具体为枸杞（LyciumchinenseMiller）中番茄红素ε-环化酶基因LmLcyE的克隆。

背景技术

番茄红素的环化反应是是植物体内胡萝卜素生物合成途径重要的分支点。番茄红素ε-环化酶(Lycopeneε-cyclase,LcyE)，能催化番茄红素的一端形成δ-环，生成δ-胡萝卜素。

类胡萝卜素是C₄₀的碳氢化合物，广泛存在于植物、一些光合细菌以及藻类中的脂溶性色素，主要包括胡萝卜素（carotenes）和它们的氧化衍生物叶黄素（xanthophylls）两大类。类胡萝卜素在植物光合作用中起着至关重要的作用，它们是光合天线和光反应中心复合体不可缺少的结构成分，还可以保护叶绿素免受强光导致的光氧化破坏。类胡萝卜素是维生素A的前体，具有增强免疫、抗氧化、增进细胞缝间联接交流、预防、延缓及治疗癌症的功能。Aluru等将细菌crtB（pds）和crtI基因串联在一起，在玉米胚乳中特异性表达，胚乳中类胡萝卜素含量提高34倍，并积累了大量的维生素A的前体：β-胡萝卜素。

生物系统中一旦形成高度活泼的具有损伤能力的自由基后，就会对细胞遗传物质和细胞膜进行强烈的破坏，导致细胞功能下降，机体衰老以及疾病的发生。类胡萝卜素，尤其是β-胡萝卜素能抑制、清除体内自由基，可以延缓衰老和预防肿瘤、血栓、动脉粥样硬化等疾病。类胡萝卜素能增加免疫系统中B细胞的活力、消灭外源入侵的病原菌，能提高淋巴辅助T细胞的活力，协助B细胞产生抗体，并提高其他免疫组分的活性；还能增加自然杀伤细胞的数目，以消除机体内被感染的细胞或癌细胞。据报道，除β-胡萝卜素外，番茄红素等也有增加免疫力的功能。

随着人类对类胡萝卜素药用价值及医疗保健作用的不断发现，对类胡萝卜素的种类和产量的需求也将越来越大，然而，类胡萝卜素很难用化学方法合成。现代分子生物学研究手段的发展，使得类胡萝卜素生物合成途径中的一系列关键酶的基因被陆续分离鉴定，为通过DNA重组技术和遗传工程调控生产类胡萝卜素开辟了道路，特别是通过类胡萝卜素基因工程获得“金色水稻”和“金油菜”，极大地增强了人们开展植物类胡萝卜素基因工程的信心。

发明内容

本发明的目的在于提供一种枸杞番茄红素ε-环化酶基因及包括该基因的重组载体。通过提取新鲜枸杞叶片总RNA，用3'RACE技术克隆了枸杞番茄红素ε-环化酶基因LmLcyE，得到完整的基因序列为1569。构建了大肠杆菌表达载体pET28a-LmLcyE，应用大肠杆菌异源表达系统，对克隆的枸杞异戊二烯焦磷酸异构酶基因LmLcyE编码的酶活性进行了鉴定，枸杞番茄红素ε-环化酶基因LmLcyE能够催化番茄红素环化为δ胡萝卜素，使代谢向下游流动，提高α-类胡萝卜素含量。

本发明的第二个目的是提供该枸杞番茄红素ε-环化酶基因编码的蛋白质。

本发明提供了一种枸杞番茄红素ε-环化酶基因LmLcyE，如序列表SEQIDNO.1中所示的核苷酸序列。

本发明提供了一种上述枸杞番茄红素ε-环化酶基因LmLcyE编码的蛋白质，如序列SEQIDNO.1中所示的氨基酸序列。还包括该所示的核苷酸序列添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸的70%以上同源序列或者其等位基因及其衍生的核苷酸序列。

本发明提供了一种上述枸杞番茄红素ε-环化酶基因LmLcyE重组克隆载体pMD18-T-LmLcyE。

含有上述的枸杞番茄红素ε-环化酶基因LmLcyE的重组载体，这些重组载体包括质粒。所述的质粒表达载体大肠杆菌表达载体pET28a-LmLcyE。

含有上述枸杞番茄红素ε-环化酶基因LmLcyE完整编码阅读框序列的宿主细胞，如含有上述重组载体的宿主细胞也属于本发明的保护范围。所述的宿主细胞选自大肠杆菌细胞。

本发明提供了一种番茄红素ε-环化酶基因LmLcyE编码的蛋白在大肠杆菌中的表达应用。

本发明的克隆方法由下述步骤组成：