[发明专利]一类二咖啡酰基奎尼酸衍生物制备鞘磷酸一胺醇受体1抑制剂的抗炎用途

说明书

技术领域

本发明涉及一类二咖啡酰基奎尼酸类鞘氨醇-1-磷酸1受体拮抗剂的抗炎用途。

背景技术

S1P受体(sphingosine-1-phosphatereceptor，S1PR)是G蛋白偶联受体家族成员之一，包括S1P1～S1P5，主要与G蛋白α亚型偶联发挥作用。

炎症是具有血管系统的活体组织对损伤因子所发生的防御反应为炎症。血管反应是炎症过程的中心环节。炎症是临床常见的一个病理过程，可以生于机体各部位的组织和各器官。急性炎症平时具有红、肿、热、痛、机能掩藏等变化，同随时常伴有发热、白细胞增多等全身反应。是机体对于刺激的一种防御反应。

炎症的产生实质上是机体与致炎因子进行抗争的反映。这种分歧抗争贯穿炎症过程的始终。致炎因子作用于机体后，一方面引发组织细胞的损坏，使局部组织细胞显现变性、坏死；另一方面，诱导机体抗病机能增加，以益于清除致炎因子，使受损组织得到修复，从而使机体的内环境以及内环境和外环境之间达到新的均衡。S1PR通过激活多条细胞内信号途径发挥不同的生物学功能，包括调节细胞迁移、增殖、凋亡及细胞内钙离子动员、炎症因子和黏附分子表达，以及调控血管发生、血管紧张度和通透性等，进而对心血管系统发挥重要影响。S1P1广泛表达于各种组织和细胞，在保持血管通透性等方面具有协调作用。

目前研究认为鞘氨醇-1-磷酸受体拮抗剂与多种细胞表面相应受体结合，在免疫调节方面具有促进淋巴细胞归巢、抑制淋巴细胞外流，诱导淋巴细胞凋亡，并能影响树突状细胞及调节性T细胞功能另小鼠实验显示S1P1在血管重建、神经形成、免疫细胞迁移、内皮细胞屏障功能等方面发挥重要作用。所以建立S1P1拮抗剂筛选模型对治疗炎症和心血管等疾病具有重要意义。

发明内容

本发明在采用鞘氨醇-1-磷酸1受体拮抗剂高通量筛选模型，通过功能性验证寻找先导化合物，发现了一类二咖啡酰基奎尼酸类鞘氨醇-1-磷酸1受体拮抗剂，为新型的抗炎药开发提供先导化合物。本发明可为此类临床抗炎治疗药物的开发提供先导化合物，为新型抗炎药物开发提供线索和实验依据。

本发明的技术方案为：在中国仓鼠卵巢癌细胞(CHO)内稳定转染鞘氨醇-1-磷酸1受体，建立鞘氨醇-1-磷酸1受体拮抗剂靶向激动剂高通量筛选模型，初筛，复筛，构效关系分析，得到一类具有抗炎作用的候选药物。具体步骤如下：

步骤一：建立及培养稳定转染鞘氨醇-1-磷酸1受体的CHO细胞株。

步骤二：激动剂模型建立及阳性药验证，确定激动剂的EC₈₀。

步骤三：拮抗剂模型建立及阳性性药验证。

步骤四：采用稳转细胞株和实验确定的最佳检测条件对化合物进行鞘氨醇-1-磷酸1受体拮抗剂的高通量筛选，得到有明显量效关系的化合物。

本发明二咖啡酰奎尼酸在菊科、豆科、伞形科、忍冬科及旋花科植物中广泛存在，常见的有1，5-二-O-咖啡酰奎尼酸、3，5-二-O-咖啡酰奎尼酸(AF-P1)、4，5-二-O-咖啡酰奎尼酸(AF-P2)及3，4-二-O-咖啡酰奎尼酸等。本发明人在中药药效物质基础研究过程中，发现二咖啡酰奎尼酸衍生物对鞘氨醇-1-磷酸1受体有显著的抑制作用，可以作为高效、低毒的抗炎先导化合物用于临床抗炎用途。

附图说明：

图1：激动剂量效曲线

图2：拮抗剂量效曲线

图3：先导化合物量效曲线

具体实施方式

以下结合附图说明本发明的具体实施方式：

二咖啡酰基奎尼酸对鞘氨醇-1-磷酸1受体的拮抗作用研究。

1.实验材料

(1)完全培养：DMEM；10％FBS；100U/mLPenicillin；100μg/mLStreptomycin；1000μg/mLG418。

(2)StimulationBuffer(SB)：含1mMIBMX的DMEM。

(3)主要仪器：CO₂培养箱；384孔板；Paradigm^TMDetectionPlatform。

2.建立及培养稳定转染鞘氨醇-1-磷酸1受体的CHO鞘氨醇-1-磷酸1细胞株。

3.最佳细胞数确定

(1)配制Forskolin梯度稀释液：需要用Forskolin对细胞进行刺激，所以应将Forskolin储备液逐级稀释为最终浓度的2倍。