[发明专利]一种双特异性抗体活化的T细胞及制备方法与应用

说明书

本发明涉及一种双特异性抗体活化的T细胞及制备方法与应用，包括如下步骤：S1、取外周血进行离心，分离细胞和血浆，然后灭活血浆中的补体，收集细胞和血浆，备用；S2、将获得的细胞稀释成悬液，分离出单个核细胞，洗涤，备用；S3、将获得的单个核细胞加入无血清培养液中，加入双特异性抗体、靶细胞、细胞因子和血浆，随后按照常规方法进行孵育培养，收集培养的细胞，采用生理盐水离心洗涤，获得所述的双特异性抗体活化的T细胞；所述双特异性抗体具备活化T细胞的功能，双特异性抗体与T细胞表面抗原的解离系数大于1×10^‑7，与靶细胞表面抗原的解离系数小于1×10^‑9；双特异性抗体分子量为小于50KD；通过上述方法制备得到双特异性抗体活化的T细胞。

技术领域

本发明属于细胞免疫学技术领域，具体涉及一种双特异性抗体活化的T细胞及制备方法与应用。

背景技术

肿瘤的过继免疫治疗是将自体或异体的免疫活性细胞经过体外扩增后输入患者体内，直接杀伤肿瘤细胞，调节和增强机体的免疫功能，主要包括LAK细胞、CD3AK细胞、TIL细胞、CTL细胞、NK细胞和CIK细胞的免疫治疗。过继免疫治疗作为肿瘤综合治疗中的一个新方法，已经与常规手术治疗、放疗、化疗及细胞因子和分子靶向治疗广泛联合，成为肿瘤综合治理的一个组成部分，在多种肿瘤的治疗中展示了广泛的应用前景。

其中，T-细胞(即T淋巴细胞)输入(transfusion)，称为过继T-细胞疗法,已经过测试用于癌症和慢性感染的治疗。过继T-细胞疗法具有增强抗肿瘤免疫,提高疫苗效力以及限制移植物抗宿主疾病的潜力。过继T-细胞疗法用作细胞源，尤其是,细胞毒性T-细胞(CTLs),或肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)。在现有技术中常采用双特异性抗体“武装(arm)”(活化的)T-细胞以形成它们和肿瘤细胞表面抗原之间的桥梁，以增强T-细胞的杀瘤效应。双特异性抗体(bispecific antibody，BiAb)是含有两种特异性抗原结合位点的人工抗体，能在靶细胞和功能分子(细胞)之间架起桥梁，使功能分子(细胞)集中在靶细胞周围，进而对靶细胞进行杀伤，产生靶向性的效应功能。BiAb在生物医学中，特别是在肿瘤的免疫治疗中具有广阔的应用前景。通过BiAb介导细胞毒作用杀死肿瘤细胞是当前免疫治疗应用研究的热点之一，其主要特点是BiAb能同时结合肿瘤相关抗原和免疫效应细胞上的靶分子，直接触发免疫效应细胞对肿瘤细胞的特异性杀伤。

如中国专利文献CN104630146A中公开的肿瘤细胞特异性多克隆T细胞制备方法及其应用，包括如下步骤：(1)获取外周血单个核细胞；(2)将获取的外周血单个核细胞与基因修饰肿瘤细胞混合；(3)将获取的混合细胞重悬于含有能够维持细胞生长、增殖和分化的细胞因子的培养基中。通过上述所制备的肿瘤细胞特异性多克隆T细胞，主要在预防或治疗癌症的药物中的应用，其优点在于制备的肿瘤细胞特异性多克隆T细胞具有数量多、特异性高和杀伤能力强等特性，此外，该制备方法还具有工艺简单而且成本较目前特异性T细胞制备成本显著降低。然而，上述方案中通过双特异性抗体的连接，使肿瘤细胞对T细胞进行抗原递呈，然后激活T细胞，再杀伤靶细胞，使得制备的肿瘤细胞特异性多克隆T细胞具有特异性高的特点，由于其具有高特异性，则产生特异性杀伤效果，肿瘤细胞特异性多克隆T细胞仅能杀伤靶细胞，而对于非靶细胞则没有杀伤作用。

鉴于现有技术中还未提出一种方法制备具有扩增能力强、细胞活性强、细胞毒性强和细胞数量多的具有非特异性杀伤效果的T细胞。为此，本发明提供了一种双特异性抗体活化的T细胞及制备方法与应用。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题在于提供了一种双特异性抗体活化的T细胞及制备方法与应用。

为此，本发明提供了一种双特异性抗体活化的T细胞的制备方法，包括如下步骤：

S1、取外周全血进行离心，分离所述外周血中的细胞和血浆，然后灭活所述血浆中的补体，收集所述细胞和血浆，备用；

S2、将所述步骤S1中获得的细胞稀释成悬液，分离出单个核细胞，然后洗涤，备用；