[发明专利]一株重组大肠杆菌及其在发酵生产[2Fe2S]铁氧还蛋白中的应用

说明书

本发明公开了一株重组大肠杆菌，所述菌命名为大肠杆菌(Escherichia coli)pCodonPlus/pRKISC/pETDuet‑S33[2Fe2S]Fd，该菌株含有来源于根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)S33的[2Fe2S]铁氧还蛋白基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述重组大肠杆菌是将[2Fe2S]铁氧还蛋白基因连接入pETDuet‑1载体，制得重组质粒命名为pETDuet‑[2Fe2S]，并将制得的重组质粒转入含有pCodonPlus和pRKISC质粒的E.coli C41(DE3)中获得。本发明还公开了所述重组大肠杆菌在发酵生产[2Fe2S]铁氧还蛋白中的应用，实验证实：每升发酵培养物最终可以获得23mg纯化后的[2Fe2S]铁氧还蛋白，远大于之前报道的从野生菌中纯化出来的0.03mg的产量，预示本发明提供的重组大肠杆菌在工业化生产中具有很好的应用前景。

技术领域

本发明涉及基因重组工程菌及其应用，尤其涉及一种用于发酵生产[2Fe2S]铁氧还蛋白的重组大肠杆菌及其应用。

背景技术

铁氧还蛋白是一类含铁硫簇的酸性蛋白，其中的铁硫簇又主要分为[4Fe4S]、[2Fe2S]、[3Fe4S]等类型。铁氧还蛋白作为一种常见的电子载体，参与呼吸作用、光合作用、发酵等重要代谢过程。目前，商业上出售的只有来自菠菜的[2Fe2S]型铁氧还蛋白，然而因物种差异，该铁氧还蛋白在分析来自其他物种的酶的时候表现出不同的效率，且该蛋白价格非常昂贵，这在很大程度上限制了铁氧化还原蛋白的应用和科学家对铁氧还蛋白相关的酶和代谢过程的研究。

在已有的文献报道中，大部分铁氧还蛋白是从野生细菌等生物体中纯化获得的，也有通过异源表达来制备，但这些方法具有很多不足，比如消耗大量的时间，纯化步骤繁琐，表达量低，铁氧还蛋白的铁硫簇组装不完整而活力较低，最终产量和纯度较低等。基于此，研究和开发能够高效表达[2Fe2S]铁氧还蛋白的方法成为目前亟待解决的课题，经检索，有关能够高效表达[2Fe2S]铁氧还蛋白的重组大肠杆菌及其在发酵生产[2Fe2S]铁氧还蛋白中的应用还未见报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种高效表达2Fe2S铁氧还蛋白的重组大肠杆菌及其应用。

本发明所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌命名为大肠杆菌(Escherichia coli)pCodonPlus/pRKISC/pETDuet-S33[2Fe2S]Fd，该菌株含有来源于根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)S33的[2Fe2S]铁氧还蛋白基因，其核苷酸序列如SEQID NO.1所示；所述重组大肠杆菌是将[2Fe2S]铁氧还蛋白基因连接入pETDuet-1载体，制得重组质粒命名为pETDuet-[2Fe2S]，并将制得的重组质粒转入含有pCodonPlus和pRKISC质粒的E.coli C41(DE3)中获得。

本发明所述的重组大肠杆菌在发酵生产[2Fe2S]铁氧还蛋白中的应用。

其中，所述重组大肠杆菌发酵生产[2Fe2S]铁氧还蛋白的方法是：

(1)将重组大肠杆菌菌株以体积比1～5％的接种量接种到含有抗生素和铁硫源的TB培养基中，在37±1℃和180±10rpm转速条件下培养2～3小时至OD_620nm为0.4～0.6，获得菌液；

其中，上述TB培养基的配方及组分终浓度是：Tryptone 12g/L，Yeast extract24g/L，Glycerol 4ml/L，KH₂PO₄2.3g/L，K₂HPO₄12.5g/L；

上述抗生素分别是终浓度为25μg/ml的氯霉素，终浓度为10μg/ml的四环素，终浓度为100μg/ml的氨苄青霉素；