[发明专利]一种改良简化的植物染色体荧光原位杂交方法

说明书

本发明提供了一种改良简化的植物染色体荧光原位杂交方法。由于该方法不包括杂交前对标本玻片的长时间脱水过程和杂交后对标本制片的多次漂洗流程，因此是一种对生物细胞样品中的核内染色体进行快速原位杂交的技术。所述方法主要涉及：1）通过变温催芽、8‑羟基喹啉预处理和卡诺固定液固定植物根尖分生区细胞分裂旺盛的组织，获得图像清晰、染色体分散良好的中期分裂相标本；2)不同标记荧光探针混合后，一次变性完并低温保存，可实现长期多次使用；3)标本制片采用NaOH醇溶液变性；4）杂交反应过程中，通过简化多步脱水、漂洗等操作步骤，从而极大地精简了整个繁琐的杂交流程。尤其是，所述方法特别适用于快速大规模检测和分析植物远缘及近缘杂交种中的外源染色体和染色体片段，同时很好地保持了标本染色体形态和结构的真实性。

技术领域

本发明涉及一种改良的基于碱变性的荧光原位杂交方法，由于该方法不包括杂交前对标本玻片的长时间脱水过程和杂交后对标本制片的多次漂洗流程，因此是一种对生物细胞样品中的核内染色体进行快速原位杂交的技术，属于分子细胞遗传学及染色体工程技术领域。

背景技术

荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization, FISH）是20世纪80年代在放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种重要的非放射性分子细胞遗传学技术，是以非放射性荧光标记取代放射性同位素标记而形成的一种新的原位杂交方法。FISH技术是根据核酸碱基互补配对原理，用半抗原标记DNA（或者ＲNA）探针，与经过变性的单链核酸序列互补配对，通过带有荧光基团的抗体去识别半抗原进行检测，或者用荧光基团对探针进行直接标记并与目标序列结合，最后利用荧光显微镜直接观察目标序列在细胞核、染色体或切片组织中的分布情况。从其诞生发展至今，FISH技术已完全克服了同位素杂交的不足，诸如探针不稳定、自显影时间长、放射线的散射使得空间分辨率不高以及同位素操作较繁琐等，逐渐形成了安全、快速、灵敏度高、探针能长期保存、能同时显示多种颜色等优点，不但能显示细胞分裂中期分裂相，还能显示细胞分裂间期核。截至目前，FISH已被广泛应用于染色体的识别、DNA序列或基因的定位、核型分析、基因组进化研究、物理图谱的构建、转基因生物的鉴定等；

在植物远缘及近缘杂交种的遗传学分析与育种研究中，FISH技术在外源染色体的识别、畸变染色体的检测与分析方面发挥着重要的作用，为染色体或基因组的研究提供了强大的工具。无论是创建用于染色体细胞作图的遗传突变体，还是创制育种上的新种质资源，开展大量的基于FISH技术的遗传材料筛选是必不可少的。这就要求具有一套周期短、简单、易于操作、高效的FISH技术。然而纵观当前广泛使用的经典荧光原位杂交方法，虽然经过了不断的改进与完善，但关键的杂交程序操作复杂，步骤繁琐，极大地降低了实验效率。此外，有些经典杂交程序操作过程作中还需要使用具有毒性的变性试剂，不仅对实验操作人员的身体健康构成威胁，而且对生态环境造成危害；

针对现有FISH技术操作步骤繁琐与周期长，以及部分方法存在的安全隐患等问题，本发明在利用成本低廉、易于配制、无毒性、重复利用率高的NaOH醇溶液作为变性剂的基础上，通过简化脱水和漂洗等繁杂步骤，不仅极大地缩短了试验流程，而且避免了经典杂交方法中由于热变性和冗长漂洗等引起的染色体失真问题，保持了染色体的最佳形态，更有利于对外源染色体的鉴定与结构组成分析以及染色体间相互重组的观察。故本发明既体现了简单高效、生态环保、经济实用的特征和优势，特别适用于快速大规模检测和分析植物远缘或近缘杂交种中的外源染色体和染色体片段，同时又很好地保持了标本染色体形态和结构的真实性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种简便、高效、实用，能够规模化检测分析或筛选植物远缘及近缘杂交种中外源染色体和染色体片段的荧光原位杂交方法，其包括以下步骤：

1) 根尖培养。将植物种子置于底层铺有湿润滤纸的培养皿中，在23℃黑暗培养箱中催芽，待种子露白后，连同培养皿一起转移至4℃冰箱，放置1-3天。然后继续转移到23℃黑暗培养箱中继续催芽，至根系长约2-3cm；