[发明专利]一种肺癌早期检测用甲基化标志物及其检测方法

说明书

本发明涉及一种肺癌早期检测用甲基化标志物及其检测方法，甲基化标志物包括PCDHGB6、HOXA9、MGMT和microRNA‑126基因。采用本发明的标志物进行联合检测具有快速、高通量、灵敏和特异性好等特点，检测方法不仅适用于肺癌早期的检测，也可以用于肺癌晚期的检测，具有良好的应用前景。

技术领域

本发明属于肺癌检测领域，特别涉及一种肺癌早期检测用甲基化标志物及其检测方法。

背景技术

肺癌，又称原发性支气管癌，是对人类健康危害最大的恶性肿瘤之一，其死亡率居各类恶性肿瘤之首。世界卫生组织预测，到2025年中国每年将有超过一百万新发病例，从而极大地危害了我国人们的生命安全和身体健康。研究认为，肺癌的总5年生存率仅10％-16％，I期患者的5年生存率可达65-75％，而II～IV期病人总的5年生存率则从40％下降到5％。由于肺癌的发病原因及发病机制极为复杂，且临床表现具有个体差异，多数患者就诊时已发展至晚期，因此早发现、早诊断、早治疗对延长肺癌恶性肿瘤患者生存期和降低死亡率有着重大意义。

肺癌的发生和发展是一个非常复杂的多因素、多阶段调控异常的过程，是遗传学与表观遗传学共同作用的结果。遗传学调控是指核苷酸序列的改变，包括碱基的突变、缺失、插入、重组等；而表观遗传学调控主要通过DNA甲基化和组蛋白修饰等方式来影响基因转录活性。DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶的作用下,S-腺苷甲硫氨酸的甲基(-CH3)共价结合到DNA分子的胞嘧啶(C)碱基的5位碳原子上，形成5-甲基胞嘧啶(5mC)，但并不改变DNA的序列。近年来的研究表明，肺癌的发生发展与抑癌基因启动子区CPG岛甲基化导致的抑癌基因表达失活有关,且其可能发生在肺癌的早期,是一个很有潜力的早期诊断肺癌的分子指标。因此，联合检测多个基因启动子的甲基化状态，对肺癌的诊断、治疗、预后判断等方面具有重要意义。

目前，甲基化的检测方法主要有甲基化特异性PCR、亚硫酸氢盐测序法和甲基荧光法。然而这些方法存在操作繁琐、假阳性率高、成本较高等缺点，限制了其在临床实验室的广泛应用。近年来发展的高分辨率溶解曲线技术[Wojdacz TK,Dobrovic A.Methylation-sensitive high resolution melting(MS-HRM):a new approach for sensitive andhigh-throughput assessment of methylation.Nucleic Acids Res.2007；35(6):e41]、[Migheli F,Stoccoro A,CoppedèF,et al.Comparison study of MS-HRM andpyrosequencing techniques for quantification of APC and CDKN2A genemethylation.PLoS One.2013；8(1):e52501]是将PCR扩增和溶解曲线分析结合在一起，由于目的片段的微小序列差异引起PCR溶解温度的改变，从而可以对基因突变、基因分型、基因甲基化等进行检测。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种肺癌早期检测用甲基化标志物及其检测方法，采用该标志物进行联合检测具有快速、高通量、灵敏和特异性好等特点，检测方法不仅适用于肺癌早期的检测，也可以用于肺癌晚期的检测，具有良好的应用前景。

本发明的一种肺癌早期检测用甲基化标志物，所述甲基化标志物包括PCDHGB6、HOXA9、MGMT和microRNA-126。

所述PCDHGB6上游引物序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物序列如SEQ ID NO.2所示；

所述HOXA9上游引物序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物序列如SEQ ID NO.4所示；

所述MGMT上游引物序列如SEQ ID NO.5所示，下游引物序列如SEQ ID NO.6所示；