[发明专利]一种提高棉花再生及转化效率的方法及应用

权利要求书

1.一种提高棉花转基因受体材料的转化及再生能力的方法，其特征在于，包括下列步骤：

A、在愈伤组织诱导阶段，利用含有IBA+KT 和2,4-D+KT两种不同的激素组合的愈伤诱导培养基对棉花植株的再生能力进行评估，测定愈伤诱导效率、愈伤增殖速度、愈伤质量以及愈伤分化时间和效率，得到再生能力超过棉花组织培养模式材料珂字棉棉310、棉312和泗棉3号的优良基因型Y668，将所得的棉花品种Y668作后续驯化试验；

B、利用农杆菌介导的遗传转化方法转化棉花品种Y668，获得T0转基因后代，使T0转基因植株自交获得T1代分离群体，选择T1群体中的阴性单株作为下一步驯化对象；

C、对R0代阴性分离单株进行连续两次的再生试验，依次获得R1，R2群体，在R1,R2世代中，以棉花品种Y668为对照，剔除农艺性状有变异的株系，在驯化的R1，R2群体中保留原始品种的典型农艺性状；

其中：

步骤B中所述农杆菌介导的遗传转化方法是指以绿色荧光蛋白GFP为报告基因，通过农杆菌介导的遗传转化方法，获得转基因植株T0，具体步骤如下：

（1）选择饱满、健康的Y668棉花种子剥去种皮后，用0.1%的HgCl2浸泡10 min，再用无菌水洗涤3次，将灭菌后的Y668棉花种子接种于无菌苗萌发培养基上，在28℃黑暗条件下于恒温箱中培养4-6 d后, 取无菌苗下胚轴切成0.5-0.8 cm小段，接种于0.5OD的用农杆菌活化培养基悬浮的农杆菌菌液中，侵染10 mim后，用无菌滤纸吸干下胚轴表面的菌液，将下胚轴接种在共培培养基的培养皿中，在21℃，黑暗条件下共培养2天，最后将下胚轴放入含有头孢霉素500mg/L的无菌水中，冲洗3遍，吸干表面水份后，接种到选择培养基中，每1个月继代1次；

（2）将步骤（1）所得的愈伤组织转到分化培养基中，至产生体细胞胚及幼苗；

（3）将步骤（2）所得的体细胞胚及幼苗转入到胚萌发及成苗培养基中，直至获得再生植株；

（4）将步骤（3）所得的再生植株进行水培、驯化处理，然后移栽到温室土钵中；

（5）将步骤（4）获得的再生植株进行PCR和荧光检测鉴定，筛选获得阳性单株，通过使阳性植株自交获得分离群体，再通过荧光检测和PCR方法，鉴定出T1群体的中阴性分离单株，使其自交后获得R0群体；

其中：

用于鉴定阳性植株的PCR的引物序列如下：

GFP-正向引物：GTT CTC TGG ATC CAT GGT GAGCAA GGG CGA GGA G，

GFP-反向引物：GAT CTT CTC TTG GAC AGC TCGTCC ATG CCG；

PCR反应程序：94℃预变性2 min；94℃变性 1min, 63℃退火 1min, 72℃延伸1.5min，重复30 循环；72℃延伸10 min；4℃保存；

用于转基因植株的GFP荧光检测的步骤如下：分别从再生材料的不同组织，器官切取后，置于体式荧光显微镜下检测GFP 基因的表达情况；

（6）以获得的R0代群体为转化受体，通过连续组织培养对R0代群体进行再生2次，选择典型的R2群体进行自交，得到转基因受体材料Jin668，具体步骤如下：

1）选择饱满、健康的R0植株的棉花种子剥去种皮后，用0.1%的HgCl2浸泡10 min，再用无菌水洗涤3次，接种于无菌苗萌发培养基上，黑暗条件下，置于28℃恒温箱中培养4-6 d,取无菌苗下胚轴切成0.5-0.8 cm小段，接种于DK愈伤诱导培养基中，每月继代一次，共继代2-3次；

2）将所得的愈伤组织转移到到分化培养基中，至产生体细胞胚胎及幼苗，将所得的体细胞胚胎及幼苗转入到胚萌发及成苗培养基中至获得再生植株，从再生植株上收获种子命名为R1群体；

3）重复步骤2）的再生过程，获得R2群体，

4）对R1群体、R2群体内的每个株系进行农艺性状考察，保留有原始亲本主要农艺性状的株系，其余的予以淘汰，最终选择得到保持原始品种的典型农艺性状、再生能力和转化效率高的R2群体；

上述培养中的培养基的组分及配比：

无菌苗萌发培养基：1/2 MS大量元素，15g/L葡萄糖和2.5g/Lphytagel；

DK愈伤诱导培养基：MS无机盐+B5维生素，24-D 0.1 mg/L，KT 0.1 mg/L ，3% Glucose和0.3% Phytagel；

IK愈伤诱导培养基: MS无机盐+B5维生素，IBA 0.5 mg/L，KT 0.1 mg/L ，3% Glucose和0.3% Phytagel；

农杆菌活化培养基：胰化蛋白胨5 g/L，NaCl 5 g/L，MgSO₄.7H₂O 0.1 g/L，KH₂PO₄0.25g/L，甘露醇5 g/L和甘氨酸1.0 g/L；pH5.6；

共培养培养基：MS+B5维生素，2，4-D 0.1mg/l，KT 0.1 mg/l ， 50mg/l AS，3% Glucose和0.25% Phytagel；pH5.6；

选择培养基：MS无机盐+B5维生素，2，4-D 0.1 mg/L，KT 0.1 mg/L ，3% Glucose，0.3%Phytagel，卡那霉素50 mg/L和头孢霉素400 mg/L；pH 5.9；

分化培养基：MSB培养基中去掉NH4NO3, 将KNO3用量加倍+Gln 1.0g/L+Asn 0.5g/L +IBA 0.5 mg/L+KT 0.15 mg/L+3%Glucose+0.25% Phytagel，pH5.9;

胚萌发及成苗培养基：1/2MS无机盐＋B5有机物，15g/L葡萄糖和2.5g/L的Phytagel。