[发明专利]一种同时检测对虾HPV、MBV和IHHNV的多重PCR检测引物、试剂盒及用途

说明书

本发明公开了一种同时检测对虾HPV、MBV和IHHNV的多重PCR检测引物、试剂盒及用途。所述引物分别为HPV‑F和HPV‑R、MBV‑F和MBV‑R、IHHNV‑F和IHHNV‑R，序列如SEQ ID NO:1和2，SEQ ID NO:3和4，SEQ ID NO:5和6所示。本发明的引物彼此间无交叉，且不与其它病毒产生交叉，假阳性率低，能够特异性的检测出分布于世界各地不同地区的3种病毒的病毒株，具有广泛适用性，具有非常高的特异性和敏感性，检测限低。同时对检测的病毒基因片段无需再进行克隆、测序和序列比对。一次实验即可检测出待测样品中是否含有这三种病毒中的一种、两种或三种。

技术领域

本发明涉及海洋生物病原检测技术，具体涉及一种同时检测对虾肝胰腺细小病毒(Hepatopancreatic parvovirus,HPV)、斑节对虾杆状病毒(Monodon baculovirus,MBV)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(Infectious hypodermal and hematopoietic necrosisvirus,IHHNV)的多重PCR检测引物、试剂盒及用途。

背景技术

对虾肝胰腺细小病毒(Hepatopancreatic parvovirus,HPV)属于细小病毒科，浓核病毒亚科，平均直径22-23nm，有包涵体，单链DNA病毒(ssDNA)，无包膜二十面体。其在病毒学中属于慢性感染类型，传染性强，发病率高。对虾感染肝胰腺细小病毒后,肝胰腺上皮细胞肿大，变性，尤其在疾病充分发展期的病虾肝胰腺、鳃组织，以及后胃和前中肠粘膜层细胞坏死解体，最后肝胰腺仅剩下一团结缔组织，以至病虾失去消化吸收功能，呼吸器官也遭到严重损害，造成窒息而死。

对虾肝胰腺细小病毒是已知的导致对虾生长缓慢的主要细小病毒之一。HPV已在世界各地的野生对虾和养殖对虾中被发现。其致病率高，分布广，对对虾养殖业可造成巨大的经济损失。HPV很少单独感染对虾，多与其他多种病原性的病毒发生混合感染，并且在大多数情况下，重感染的对虾却没有明显的炎症反应。致病虾生长变缓、活动呆滞、食欲减退、较少蜕皮，虾体表常有杂物附着；成虾甲壳变软，腹部肌肉变白，常并发二次性细菌感染，以弧菌较为常见。迄今为止，还没有有效的预防措施可减少对虾的感染。

斑节对虾杆状病毒(Monodon baculovirus,MBV)又名草虾杆状病毒病(grassshrimp baculovirus)、因首次在斑节对虾(Penaeus monodon)中发现而得名。1987-1988年MBV在台湾等地区爆发流行，1991年在大陆发现。在中国、泰国、新加坡、印度尼西亚、马来西亚均有广泛分布。

斑节对虾杆状病毒属杆状病毒科，核型多角体病毒属A亚群。病毒为杆状，有囊膜，有包涵体，为双链DNA病毒(dsDNA)。核衣壳大小为42×246nm，连囊膜大小约为75×324nm。不同种类的虾所观察到的病毒颗粒大小略有差异。斑节对虾杆状病毒感染部位是肝胰腺及前中肠的上皮细胞核，并在细胞核内产生多个嗜酸性的圆形或椭圆形的病毒包涵体。

致病虾食欲减少，活动呆滞，鳃、附肢和体表常带有大量的附生生物。受感染后幼体除部分体色加深外，并无特别症状，多数携带病毒的虾活动正常。受感染幼体群常常无明显的症状表现而出现大量死亡，更因继发感染其它病毒、细菌或附生物而导致幼体大量死亡。

传染性皮下及造血组织坏死病毒(Infectious hypodermal and hematopoieticnecrosis virus,简称IHHNV)最初于1981年在美国夏威夷地区养殖细角滨对虾(Litopenaeus stylirostris)中被发现(Lightner et al，1983)。