[发明专利]一种利用重组大肠杆菌高效生产角蛋白酶的发酵方法

说明书

本发明公开了一种利用重组大肠杆菌高效生产角蛋白酶的发酵方法，属于发酵工程领域。本发明构建了一株可以高效分泌高活性角蛋白酶的重组大肠杆菌，并实现其在摇瓶或者发酵罐中生产制备角蛋白酶。最后通过培养基优化和发酵策略改进，实现高效制备角蛋白酶制剂，发酵酶活从原来的412U/mL提升到4500U/mL(发酵时间48h)。本发明的角蛋白酶制剂，在洗涤、纺织、饲料消化、医药等领域具有很好的应用前景。

技术领域

本发明涉及一种利用重组大肠杆菌高效生产角蛋白酶的发酵方法，属于发酵工程领域。

背景技术

角蛋白酶(Keratinase)为一种可以特异性降解角蛋白的酶类，由真菌、放线菌和细菌等多种微生物产生。角蛋白酶在食品、医药、饲料、精化和制革等工业中广泛应用，具有嫩化肉类、生产高级营养品、免疫制剂和饲料添加剂以及美容、软化皮革等作用，并可导致疯牛病和人类克雅氏症的阮蛋白(Prion)的降解。

目前已经报道的角蛋白酶基因主要来自国外的一株地衣芽胞杆菌的kerA基因。虽然角蛋白酶有着巨大的应用和研究价值，但是从野生菌发酵制备角蛋白酶产量低，活性不稳定，大大降低了角蛋白酶的开发和运用。

发明内容

本发明将来自嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)BBE11-1的角蛋白酶进行分子改造，获得一种新的高活性的角蛋白酶并对其基因序列在大肠杆菌中高效分泌表达，然后通过一系列的培养优化，确定其在3L发酵罐中的最佳发酵培养基和发酵培养策略，获得角蛋白酶高产。这对角蛋白酶的规模化生产及推广具有深远的技术指导意义。

本发明的第一个目的是提供一种高活性角蛋白酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

在本发明的一种实施方式中，所述角蛋白酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的第二个目的是提供表达权利要求1所述角蛋白酶的基因工程菌或细胞系。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌以E.coli BL21(DE3)为宿主、pET22b(+)为表达载体，表达SEQ ID NO.4所示的角蛋白酶。

在本发明的一种实施方式中，所述角蛋白酶基因连接在pET22b(+)的NcoI和XhoI位点之间。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程大肠杆菌的构建方法，具体方案如下：

(1)根据来自嗜麦芽窄食单胞菌(S.maltophilia)BBE11-1的一种角蛋白酶的多次分子改造获得的一种活性较高突变体的基因，设计引物克隆获得，或者通过化学合成获得基因；氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；

(2)将该基因连入pET22b(+)质粒，双酶切位点为NcoI和XhoI，得到重组表达载体；

(3)将该重组表达载体转化进入大肠杆菌BL21(DE3)，获得具有高效分泌角蛋白酶的重组大肠杆菌。

本发明的第三个目的是提供一种高效生产角蛋白酶的方法。

所述方法是以表达SEQ ID NO.4所示的角蛋白酶的基因工程菌为生产菌株，在发酵罐上采用溶氧偶联的补料方式获得高密度菌体并高效诱导产角蛋白酶。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌以E.coli BL21(DE3)为宿主、pET22b(+)为表达载体，表达氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示的角蛋白酶。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是将基因工程菌活化后接种至含有氨苄青霉素的发酵罐基础培养基中，通过溶氧值与补料偶联的流加策略，于37℃培养至OD₆₀₀＝30，然后降温至20℃培养并加入最终浓度0.2mM的诱导剂IPTG诱导，发酵48h时离心获得上清酶液，即为粗酶液。